Mutaciones heredadas en los canales de Na voltaje dependientes (VGSC; o Nav) causan muchos desordenes de excitabilidad, incluyendo epilepsia, dolor crónico, miotonia y arritmias cardiacas.
 Entendiendo las consecuencias funcionales de las mutaciones que causan la enfermedad es probable que proporcione una información inestimable en los papeles que juegan los VGSC en la excitabilidad normal y anormal.

En este caso, se buscó poner a prueba la hipótesis de que las mutaciones causantes de enfermedades llevan al aumento de las corrientes resurgientes de Na, corrientes de Na inusuales que no han sido previamente implicadas en desordenes de excitabilidad.

Una corriente resurgente de sodio, ocurre cuando se abren canales de sodio transitoriamente durante la recuperación de la re polarización del potencial de acción. Estos canales en realidad de deberían estar inactivos. Este incremento de la corriente de sodio proporciona una influencia despolarizante después de un potencial de acción, produciendo un tipo de comportamiento contrario a la refractario. 


Hemos demostrado que:
1.    El desorden del dolor extremo paroxístico (PEPD) es una mutación en los canales de Na neuronales periféricos Nav 1,7
o    este trastrono se caracteriza por sentir un dolor quemante episodioc en las regiones oculares, del recto y  mandibulares.
o    Como el canal de Na voltaje dependiente tiene una mutación, se altera la capacidad para inactivar el canal, lo que no permite el cese del impulso nervioso correctamente. 
2.    La paramiotonia congénita (PMC) es una mutación de los canales de Na del musculo esquelético Nav 1,4
o    Es un tipo de miotonia paradójica, ya que a diferencia de otras miotonias que se alivian con el ejercicio, esta empeora. Los pacientes se quejan de rigidez muscular.
o    Fisiopatológicamente vemos que la cinética del canal de Na se prolonga mas alla de la despolarización, casi llegando al periodo de excitación muscular siguiente.
3.    SIDS (Sindrome de muerte súbita infantil)/ QT3 es una mutacion en los canales de Na cardiaco Nav 1,5.
o    es un síndrome caracterizado por la muerte repentina de un niño que es inesperada por la historia y permanece inexplicada después de una autopsia completa y una detallada investigación de la muerte escena

Todos aumentan substancialmente la amplitud de  las corrientes de Na resurgientes en una rata adulta derivada de un sistema de expresión neuronal del ganglio de la raíz dorsal. Simulaciones computacionales indican que las corrientes de Na resurgientes asociadas a  mutaciones de Nav 1,7 podria inducir disparos de PA de alta frecuencia en neuronas nociceptivas y que las corrientes resurgientes asociadas a la mutacion de Nav. 1,5 podrian ampliar los PA en los miocitos cardiacos. Estos efectos son consistentes con la fisiopatología con las respectivas canalopatias. Nuestros resultados indican que las corrientes resurgientes están asociadas con múltiples canelopatias y que probablemente serian contribuyentes importantes a los desordenes musculares y neuronales de excitabilidad.

1.- INTRODUCCIÓN

Los canales de Na voltaje dependientes son cruciales en la generación y propagación del PA de todo o nada en células excitables, como neuronas y músculos. Mas de 200 mutaciones invertidas diferentes en 7 VGSC han sido identificadas como causantes de desordenes de excitabilidad o canalopatias en humanos.
    Aunque estas canalopatias son relativamente raras, entender las consecuencias funcionales de las enfermedades por mutaciones entrega  información invaluable sobre los papeles que juegan los canales voltaje dependientes en la excitabilidad normal y anormal.
    Los canales mutados han sido ampliamente estudiados en sistemas de expresión heterologos no excitables, entregando conocimiento substancial; sin embargo una de las principales preocupaciones es que las propiedades funcionales de VGSCs en células neuronales  musculares no son siempre reproducidas con exactitud en células no excitables.

Un primer ejemplo de este fenómenos es la corriente resurgente en los VGSC:
Aunque las corrientes resurgentes de VGSC han sido registradas en las neuronas, no han sido posible registrar las corrientes resurgentes en los sistemas de expresión heterologos no excitables, y no se sabe si mutación en VGSC que causan canalopatias alteran las corrientes resurgentes.
    Las corrientes de Na resurgientes fueron por primera vez descritas en las neuronas cerebelosas de purkinje y más recientemente han sido observadas en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal.
    Normalmente; los VGSCs están abiertos,  y subsecuentemente son inactivados por la depolarizacion de la membrana.
    Canales inactivados no se pueden reabrir hasta que hayan sido hiperpolarizados por algunos o muchos milisegundos, esta es la base del periodo refractario del PA.

Las corrientes resurgentes reabren durante la repolarizacion de potencial de membrana por lo tanto son susceptibles de disparar espontáneamente y a alta frecuencia.

     Estas corrientes de Na inusuales se propone que son el resultado de un factor de bloqueo intracelular que se une a los canales abiertos y previene la clásica inactivación, pero se desliga durante la repolarización a potenciales a los cuales los canales normalmente se mantienen inactivados. 
    Tanto en células cerebelosas de purkinje como en ganglios de la raíz doral aisladas de ratones nock-out de Nav 1,6, las corrientes resurgentes son ampliamente disminuidas, lo cual indica que Nav 1,6 es normalmente el generador predominante de las corrientes resurgentes en las neuronas.
    Sin embargo, disminuciones artificiales de los VGSC via aplicación de una toxina puede inducir corrientes resurgentes en neuronas de purkinje aisladas de ratones nockout Nav 1,6. Lo cual indica que otros VGSCs distintos a Nav 1,6 tienen la capacidad para generar corrientes de Na resurgientes.
En este estudio nuestras hipótesis es que las enfermedades por mutaciones que disminuyen o desestabilizan la inactivación de los canales de Na conduce al aumento de las corrientes resurgentes.

Hemos demostrado previamente que canales recombinantes 1,6 expresados en neuronas del ganglio de la raíz dorsal puede generar corrientes resurgientes en aproximadamente el 60 % de las neuronas transfectadas, lo que indica que las neuronas del ganglio de la raíz dorsal debería ser una célula ideal de respaldo para demostrar nuestra hipótesis.

Aunque el DRG expresan múltiples VGSC, es de notar que no todas las isoformas son expresadas naturalmente en las neuronas DRG. Neuronas sensiriales de DRG adulta pueden expresar combinaciones de Nav 1,1; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9, además los Nav 1,2; 1,3; 1,5 son expresados al menos en bajos niveles en DRG de embriones de rata. Sin embargo porque las células neuronales de respaldo de DRG, las cuales pueden incluir la expresión de kinasas particulares y subunidades auxiliares es apropiado generar corrientes de Na resurgientes en Nav 1,6, propusimos que las neuronas cultivadas de DRG puede proporcionar un sistema de expresión oportuno para investigar la capacidad de otros VGSC mutantes y naturales para generar corrientes resurgientes.

Usando este sistema de expresión demostramos por primera vez para nuestro conocimiento que las enfermedades por mutaciones en tres diferentes isoformas de VGSC se asocian con 3 distintos desordenes de excitabilidad, aumentando las corrientes resurgientes de Na. En base a nuestros datos, proponemos que la corrientes de Na resurgientes juegan un papel importante y previamente desconocido papel en los desordenes de excitabilidad.


2.- RESULTADOS

Una mutacion en la puerta de inactivación de Nav 1,7 implicado en PEPD aumenta las corrientes de Na resurgientes. Nos preguntamos primero si una mutacion en en Nav 1,7  que disminuye la inactivación y causa PEPD genera corrientes de Na resurgientes.

Altamente expresados en neuronas DRG, canales Nav 1,7 son escenciales en la nocicepcion, como se evidencia en las mutaciones reversas en puntos singulares que causan un expectro de dolor sindromatico, incluyendo PEPD, y por mutaciones descensibilizantes que resultan en humanos insensibles al dolor.
    Aunque los canales Nav 1,7 no han mostrado anteriormente que producen corrientes resurgientes, las mutaciones de PEPD desestabilizan la inactivación, desplazando la tendencia de voltaje y disminuyendo el rengo de inactivación.
    Por lo tanto, hipotetisamos que las mutaciones PEPD inducen corrientes resurgientes.

Estudiamos la mutacion PEPD Nav 1,7 l1461T, localizada dentro de la particula de inactivación altamente conservada D3-D4 crucial para la inactivación de VGSC. Modificamos el tipo natural de Nav 1,7 y Nav 1,7 l1461T (referido en lo que sigue como Nav 1,7r y Nav 1,7 l1461T, respectivamente), que generan corrientes que pueden ser farmacológicamente aisladas que fueron expresadas en neuronas DRG de ratas adultas. (Figure 1, A and B).



Figura 1
Las corrientes generadas por Nav1.7 recombinante expresado en los canales
DRG neuronas. (A) Representante huellas Nav1.7r actual registrada de una neurona DRG transfectadas. (B) Representante Nav1.7r-I1461T se registrará la huella de una neurona DRG transfectadas. Corrientes se habían obtenido con despolarizaciones paso a tensiones que van desde -80 a +40 mV desde un potencial de explotación de -100 mV. (C) La mutación dolorosa
I1461T desaceleró la tasa de inactivación de Nav1.7r. Negro huella,
Nav1.7r; rastro rojo, Nav1.7r-I1461T. Las corrientes se habían obtenido con un
despolarización paso a +10 mV. (D) la inactivación en estado estacionario curvas
para Nav1.7r (negro) y Nav1.7r-I1461T (rojo) se expresa en los canales
DRG neuronas. Cultivadas de rata adulta neuronas DRG se transfectaron con
la recombinante VGSC construir y ARNhc Nav1.8 y grabaciones
se realizaron en presencia de 500 nM TTX.

Además de los canales recombinantes de interés las neuronas fueron también cotransfectadas con un segundo plásmido que sodificapara ambos EGFP, para ayudar a identificar las neuronas tranfectadas, y un ARNsh Nav 1,8 para minimizar las corrientes Nav 1,8 endógenas (ver métodos para detalles).

En las neuronas DRG, la mutación l1461T  dañó la inactivación pero no alteró la activación (datos no mostrados) de canales Nav 1,7r. El componente persistente medido al final de un pulso de 50 miliseg a -10 mv fue significativamente más grande para los canales Nav 1,7r l1461T que para los canales Nav 1,7r.estos cambios fueron idénticos a los observados en tipo nativo y canales l1461 Nav 1,7 expresados en células HEK293.

Sin embargo, en neuronas DRG, ambos canales Nav 1,7r y Nav 1,7r l1461T  también generaron corrientes resurgientes de Na. Corrienetes resurgientes de Na fueron observadas en 5 de 21 neuronas transfectadas con Nav 1,7r (figura 2, A y B), con una amplitud promedio – expresada como porcentaje del peack transiente de la corriente de Na evocada con un pulso de prueba  para -10 mV- de 1% +- 0,5% para esas 5 neuronas. Por el contrario, 20 de 30 neuronas que expresan canales Nav 1,7r-l1461T producen corrientes de Na resurgentes. La frecuencia de corriente resurgente con los canales Nav 1,7r-l1461T fue significativamente aumentado comparado con los canales Nav 1,7.



Figura 2
El resurgimiento de las corrientes son producidas por recombinante Nav1.7 canales expresa en neuronas DRG. (A y B) Representante actual huellas registrados en las neuronas que expresan Nav1.7r GRD que no lo hicieron (A) y que hizo (B) generan corrientes resurgimiento. (C y D) Representante se registrará la huella de las neuronas que expresan Nav1.7r DRG-I1461T
canales que no lo hicieron (C) y que hizo (D) generan corrientes de resurgimiento.
El resurgimiento de las corrientes eran más grandes en promedio para Nav1.7r-I1461T que Nav1.7 de canales. Corrientes se magnifican × 30 relativa a la cima
transitorios de corriente (provocado con un pulso a -10 mV) hacer hincapié en la
resurgimiento de los componentes actuales. (E) El resurgimiento de protocolo de tensión actual.
(F) dependencia de voltaje del resurgimiento actual se muestra en la D.



Por otra parte, la amplitud relativa de las corrientes resurgentes fue también significativamente mayor para Nav 1,7r-l1461T que para Nav 1,7. Debido a que todas las mutaciones PEPD caracterizadas para los datos resulta en disminución de la inactivación  de Nav 1,7, predijimos que la mutación de todos los PEPD resultarían en generación de corrientes resurgentes.

a)    Una mutación PEPD que aumenta las corrientes resurgentes aumenta la frecuencia de disparos de PA en neuronas simuladas.

Basado en el trabajo realizado en neuronas de purkinje del cerebelo, esperamos aumentar las corrientes de Na resurgientes generadas por la mutacion PEPD que resulta en PA espontaneos y/o repetitivos en neuronas DRG.

    Para probar esto nosotros realizamos una simulación computarizada de la excitabilidad de las neuronas DRG.
    Usamos un modelo establecido de la excitabilidad neurona DRG que ha sido implementado en el desarrollo de la  simulación neuronal y con modificaciones solo a la formulacion del canal de Na apropiado, se simuló y evaluó el impacto de la mutacion  de l1461T y las corrientes resurgentes sobre los disparos de PA.
    Modelos matematicos de las corrientes de Nav 1,7 y Nav 1,7-l1461T con y sin un factor bloqueante de corrientes resurgentes fueron desarrollados usando un modelo multiestatal markovtype de Nav 1,7.  Figura 3
Figura 3
Simulación de las conductancias de sodio y DRG excitabilidad de las neuronas. (A) Diagrama de modelos de Markov para conductancias VGSC. Una 8-el estado modelo de Markov se utilizó para la simulación de las conductancias VGSC sin corrientes resurgimiento. C1-C3, cerrado (no conductor) los estados; O, abierta (dirección) del Estado; I1-I4, inactivados (también no conductor) estados. Un modelo de Markov 9-estado incorporado el resurgimiento actual factor de bloqueo. El estado de obstetricia (en caja) representa los canales bloqueados por el
este factor. (B) Nav1.7 simulado (negro traza) y Nav1.7-I1461T (rojo traza) las corrientes inducidas por un paso de voltaje de -100 mV a +10 mV. (C) Simulación de corrientes resurgimiento generado por el modelo Nav1.7 (trazo negro) y Nav1.7-I1461T (rojo traza) conductancias. Modelo corrientes se suscitado con el protocolo estándar actual resurgimiento de tensión se muestra en la Figura 2E. (D) En las neuronas DRG simulado con Nav1.7 canales, 70 pA corriente de despolarización se requiere para obtener una AP con o sin
simulación actual resurgimiento. Por el contrario, sólo el 40 pA se necesita para obtener un AP en una neurona simulada con canales Nav1.7 I1461T-, y un tren de puntos de acceso de alta frecuencia se genera cuando el modelo Nav1.7-I1461T canales de generar corrientes de resurgimiento.

El factor bloqueante de corriente resurgente fue implementado usando la estrategia desarrollada por Khaliq. El avance y retroceso del  rango del factor de bloqueo fue ajustado con el fin de coincidir que la amplitud relativa de las corrientes resurgentes observadas experimentalmente. En nuestro modelo, las corrientes resurgentes inducidas por el factor bloqueante fue de un 1 % del pick de la corriente transciente en la conductancia modelada de Nav 1,7 y 2% del peack de la corriente transciente en la conductancia modelada de Nav 1,7-l1461T (figura 3C).

Las simulaciones computarizadas de los disparos de PA en neuronas DRG indicaron que, mientras que la desestabilización de  la inactivación causada por la mutación de l1461T fue suficiente para disminuir el umbral para evocar un PA, inclusión de factor bloqueante de corrientes resurgientes condujo a trenes de potenciales de acción de alta frecuencia (figura 3D). Es importante de notar que aun cuando el rango de transición de efectores para el factor bloqueante fue ajustado de manera que las corrientes resurgientes naturales fueron dobladas (2% del pick), un estimulo 70-pA aun asi evocó solo un PA en la neurona modelo.

Estos resultados indican que los factores bloqueantes de corrientes resurgientes y las mutaciones I1461T actúan sinérgicamente para aumentar la excitabilidad neuronal y que probalemente las corrientes resurgientes contribuyen a la sensación extrema de dolor asociado con mutaciones PEPD.

b)    El segmento cardiaco QT3 amplio/La mutacion del sindrome de muerte subita infantil que disminuye la inactivacion aumenta las corrientes resurgentes de Nav 1.5 y amplia la onda en el PA en un miocito modelado.

Las mutaciones que producen enfermedad que perjudican la inactivación han sido también identificadas en muchas otros VGSC, incluyendo las mutaciones de Nav1.1 y Nav1.3 asociadas con epilepsias, mutaciones de Nav1.4 asociadas con miotonias del musculo esqueletico, y mutaciones Nav1.5 asociadas con arritmias cardiacas. Mas de 50 diferentes enfermedades por mutaciones que afectan la inactivación han sido caracterizadas (consulta la tabla 1 para una lista parcial). Sin embargo, esas mutaciones han sido todas caracterizadas en sistemas de expresión heterologos que no soportan la generacion de corrientes resurgentes de sodio. Por lo tanto, porsteriormente usamos el sistema de expresión DRG para determinar si la mutacion Nav1.5 F1486L, se asocia con (LQT3/SIDS), genera un aumento de corrientes resurgentes.

Como fue anteriormente mostrado en celulas HEK293, la mutacion F1486L, la cual es también localizada en la partícula de inactivación IFMT, disminuyendo el rango de inactivación, aumentando la fracción de corrientes persistentes, u y cambiando la dependencia de voltaje de activación en la dirección despolarizarte(tabla 1).
Punto medio de tensión de la curva de inactivación de estado estable, según lo determine con un ajuste estándar de distribución de Boltzmann. BHora constante de desintegración de corriente durante 10 mV despolarización paso. CPersistent corriente medida a 50 ms durante la despolarización paso a +10 mV, reportado como un porcentaje de la amplitud de corriente de pico
provocada por la despolarización de paso. DResurgent actual de sodio se midió con el protocolo se muestra en la Figura 2E y comunicarse como un porcentaje del pico la amplitud de corriente provocada por una despolarización paso a -10 mV. El promedio de la amplitud de corriente se calculó sólo el resurgimiento de las células en las que el resurgimiento actual se ha detectado. EP <0,05 en comparación con los canales respectivos de tipo salvaje.

 Sin embargo, 9 de 18 neuronas DRG que expresaron el tipo nativo de Nav1.5 generaron corrientes resurgentes (figura 4A y 4B). en nuestro sistema de expresión, la mutacion LQT3/SIDS de Nav1.5-F1486L aumento significativamente la amplitud relativa de las corrientes resurgentes (tabla 1).

Figura4. 4
El resurgimiento de las corrientes son producidas por Nav1.5 canales. (A y B) Representante se registrará la huella de las neuronas que expresan DRG Nav1.5 que no (A) y que hizo (B) generan corrientes resurgimiento.(C y D) se registrará la Representante huellas de las neuronas DRG expresando canales Nav1.5-F1486L que no lo hicieron (C) y que hizo (D) generar corrientes de resurgimiento. El resurgimiento de las corrientes eran más grandes en promedio para Nav1.5 F1486L-que para los canales Nav1.5. Las corrientes se habían obtenido con el protocolo estándar resurgimiento actual se muestra en la Figura 2E y se han agudizado × 30 en relación con la amplitud de corriente peack.

De 17 neuronas que expresan canales Nav1.5-F1486L, 8 generaron corrientes resurgentes, con una amplitud promedio relativa de 2.0% +- 0.4% (figura 4C y 4D). Como las corrientes resurgentes de sodio son activadas durante la repolarizacion, esperamos aumentar las corrientes resurgentes en Nav1.5 para ampliar el PA, aumentar el intervalo QT, y asi contribuir a las potenciales arritmias cardiacas letales asociadas con las mutaciones LQT3/SIDS. Modelaciones matematicas de las corrientes resurgentes de sodio y simulaciones computacionales de los miocitos cardiacos (20) indicaron que este puede de hecho ser el caso (figura 5).

Figura  5
Simulaciones de Nav1.5 corrientes y puntos de acceso miocitos cardíacos. (A Nav1.5) simulado (negro traza) y Nav1.5-F1486L (azul traza) corrientes inducidas por un paso de voltaje de -100 mV a +10 mV. (B) simulado corrientes generadas por el resurgimiento Nav1.5 modelo (trazo negro) y Nav1.5-F1486L (trazo azul) conductancias. Modelo corrientes se suscitado con el protocolo estándar resurgimiento de tensión indicado en la
Figura 2E. El resurgimiento del modelo actual fue del 0,9% del pico de corriente
para Nav1.5 y el 1,7% del pico de corriente de Nav1.5-F1486L. (C) Puntos de acceso simulado de un modelo cardiomiocitos. Hubo poca diferencia entre los puntos de acceso de una célula modelo con Nav1.5 que no incluyera corrientes resurgimiento (negro traza) y las de una celda con Nav1.5 que incluía el resurgimiento corrientes (huella verde). Nav1.5-F1486L simulada sin generación actual resurgimiento de ampliar la AP (rojo traza), y este efecto se vio agravada en la simulación de Nav1.5-F1486L con la generación actual de resurgimiento (trazo azul).

c)    Una mutacion congenita que produce paramiotonia D4/S4 en los Nav1.4 que sustituye un residuo cargado y desacopla rapido la inactivacion generando corrientes resurgentes de sodio.

A continuación nos preguntamos si una mutacion que disminuye la inactivacion de Nav1.4 y causa paramiotonia congenita (PMC) induce corrientes resurgentes de sodio. Estudiamos la mutacion R1448P, la cual altera los residuos cargados extracelular mas externos en el sensor de voltaje del canal de sodio que acompla la activacion e inactivacion del canal. Curiosamente, aunque esta mutacion disminuye la inactivacion de las corrientes de Nav1.4 por aproximadamente 10 veces (figura 6A), provoca un cambio hiperpolarizante en la dependencia de voltaje de la inactivacion (tabla 1).


Figura6
Una mutación PMC induce corrientes resurgiendo en Nav1.4. (A) El paramiotonía R1448P
mutación causó una disminución pronunciada de la tasa de inactivación Nav1.4r. Corrientes
se habían obtenido con una despolarización paso a +10 mV. (B) El resurgimiento de las corrientes no se detectables en ninguna de las neuronas que expresan canales Nav1.4r. (C) Por el contrario, el
mayoría de las neuronas que expresan canales Nav1.4r-R1448P generados robusta resurgimiento
corrientes. El resurgimiento de las corrientes se habían obtenido con el protocolo se muestra en la Figura 2E y se magnifican × 20 en relación con la amplitud de corriente peack

En un estudio anterior, las corrientes resurgentes de sodio no fueron detectadas en ninguno de las 41 neuronas DRG transfectadas con los canales de sodio del musculo esqueletico del tipo nativo Nav1.4r. de nuevo, no detectamos corrientes resurgentes en ninguno de las 11 neuronas que expresan Nav1.4r (figura 6B); sin embargo, 13 de 20 neuronas que expresan canales Nav1.4r-R1448P generaron corrientes resurgentes (figura 6C), con una amplitud relativa promedio de 4.8% +- 0.7% del Peak.

Asi, al menos para Nav1.4, la disminución del rango de inactivacion parecia ser crucial en la producción de corrientes resurgentes de sodio, y el impacto sobre la mutacion sobre la dependencia de voltaje de la inactivacion puede ser menos importante.

Cabe señalar que aunque la mutacion  de R1448P no altera la dependencia de voltaje de la inactivacion, disminuye la desactivacion (el rango a los cuales se abren los canales transientes del estado cerrado) y la disminucion mas de la desactivacion podria tambien contribuir para mejorar las corrientes resurgentes, especialmente en combinación con la disminución de la inactivacion.

Corrientes resurgentes generadas por Nav1.4 es probable que aumenten los disparos de PA repetitivos en el musculo esqueletico, la cual es 1 de las características de PMC. Sin embargo, es de notar que pacientes con PMC pueden también experimentar episodios de debilidad muscular o paralisis además de la miotonia. Aunque las corrientes resurgentes pueden claramente contribuir a la actividad miotonica asociada con PMC, la inactivación incompleta observada con los canales mutantes en PMC es probable que sean un factor importante en la debilidad muscular asociada a PMC.


d)    Una mutacion de ingeniería en la compuerta de inactivacion homologa en los canales Nav1.6 aumento dramáticamente las corrientes resurgentes y desestabilizo la transición a un estado inactivado.

Porque Nav1.6 parece ser el generador predominante de las corrientes resurgentes en las neuronas cerebelosas de Purkinje y DRG, a continuación comparamos la amplitud de las corrientes resurgentes generadas por los canales Nav1.6 con los producidos por las mutaciones que producen enfermedad de Nav1.4, Nav1.5, y Nav1.7. Corrientes resurgentes fueron detectadas en 8 de 14 neuronas DRG que expresan el tipo nativo de canales Nav1.6r, con una amplitud relativa promedio de 2.4%+- 0.3% del Peak de la corriente (figura 7A). Esta amplitud relativa es similiar a la producida por la mutacion PEPD de Nav1.7r-I1461T y a la mutacion LQT3/SIDS de Nav1.5-F1486L, pero ligeramente menor que la producida por la mutacion PMC de Nav1.4r-R1448P (figura 7C).


Figura 7
Canales Nav1.6 generar grandes corrientes de resurgimiento. (A y B) corrientes Representante resurgimiento de grabado de
una neurona expresar Nav1.6r (A) y Nav1.6r I1477T- (B) canales. rastros actual se magnifican × 20 × 5,
respectivamente, en relación con el pico de corriente. (C) Comparación
de la relativa amplitud de la corriente que resurge, expresado como un porcentaje de transitorio actual, por tipo salvaje y VGSCs mutante. * P <0,05 en comparación con el canal de tipo salvaje para la isoforma dado.




Esto indica que las corrientes resurgentes producidas por las mutaciones que producen enfermedad tienen de hecho probablemente un impacto importante sobre la excitabilidad celular.
Notablemente, las mutaciones que producen una ganancia en la funcion de la enfermedad, a la fecha, no han sido identificadas en los canales Nav1.6. para determinar el impacto potencial de las mutaciones en Nav1.6 que perjudica la inactivacion, nos preguntamos si la mutación en Nav1.6 (I1477T) correspondiente a la mutación I1461T en los Nav1.7 podria aumentar las corrientes resurgentes de sodio  generadas por Nav1.6. la mutacion de Nav1.6r-I1477T cambio la dependencia de voltaje de la inactivacion en la direccion depolarizante, disminuyo el rango de inactivacion y significativamente aumento las corrientes de sodio persistentes (tabla 1).

Las corrientes resurgentes fueron observadas en 7 de 14 neuronas que expresan canales Nav1.6r-I1477T. Notablemente, esas corrientes son aproximadamente 8 veces mas grandes que las producidas tanto por los canales Nav1.6r o Nav1.7r-I1461T, con una amplitud relativa promedio de 15.3% +- 3.4% (figura 7C). Estos datos sugieren que las mutaciones que desajustan la inactivacion de Nav1.6 pueden ser letales como resultado de la propensión de Nav1.6 a generar corrientes resurgentes.

3.- DISCUSIONES

Nuestros datos muestran, por primera vez para conocimiento nuestro, que los canales Nav1.4, Nav1.5, Nav1.7 tienen la capacidad de generar corrientes resurgentes, y que la amplitud de las corrientes resurgentes de sodio relativa observada con la mutaciones que produce enfermedad que perjudican la inactivacion son de aproximadamente la misma magnitud como las corrientes resurgentes generadas por Nav1.6 bajo condiciones controladas en las neuronas cerebelosas de Purkinje y DRG. Una extensa serie de estudios sobre las neuronas de Purkinje del cerebelo indica que las corrientes resurgentes tendrian un gran impacto sobre la excitabilidad, lo que contribuye a la descarga espontánea y la aceleración de la tasa de disparo repetitivos de PA.
    Como consecuencia, se prevé que las corrientes resurgentes asociadas con las canalopatías neuronal y muscular heredables pueden afectar considerablemente los disparos de AP en las neuronas y el músculo y contribuir a la fisiopatología de la enfermedad.
    De hecho, las simulaciones por ordenador de una neurona DRG y los cardiomiocitos indica que las corrientes resurgentes podría sustancialmente exacerbar los efectos de las mutaciones de la enfermedad sobre la excitabilidad celular.

Nuestros datos proporcionan evidencia adicional de que las isoformas del canal de sodio difieren en su propensión a producir corrientes resurgentes de sodio. Demostramos que Nav1.6 estaba más inclinado a generar corrientes resurgentes que Nav1.4, Nav1.5 o Nav1.7. Por otra parte, la mutación idéntica produjo un mayor aumento de las corrientes resurgentes en Nav1.6 que en Nav1.7 (comparar Nav1.6r-I1477T datos con los de Nav1.7r-I1461T; Tabla 1 y Figuras 2 y 7). Aunque los estudios de ratones knock-out Nav1.6 indican claramente que Nav1.6 es el generador predominante de las corrientes resurgentes en las neuronas de Purkinje del cerebelo y DRG (3, 4), Las corrientes resurgentes han sido detectadas en las neuronas de Purkinje y otras del sistema nervioso central de ratones knock-out Nav1.6. canales Nav1.2 Se ha demostrado que producen las corrientes resurgentes cuando se expresan en las neuronas DRG, aunque en sólo 2 de 25 células transfectadas.

Aunque no se sabe si los canales Nav1.1 y Nav1.3 producen corrientes resurgentes, mutaciones que reducen el rango de inactivación se han identificado en estas isoformas en los pacientes con epilepsia, por lo que es concebible que las corrientes resurgentes podrian contribuir a la fisiopatologia de alguna de las epilepsias heredables.

En nuestro estudio, hemos demostrado que una mutación en el segmento de detección de voltaje  del cuarto dominio, así como las mutaciones en la partícula de inactivación IFMT, inducijeron mejorar las corrientes resurgentes, lo que sugiere que cualquier mutacion que disminuya la tasa de inactivacion en los canales de apertura rapida puede ser capaz de inducir corrientes resurgentes.

Sin embargo, es importante denotar, que el rango de inactivación puede no ser el unico determinante de la producción de corrientes resurgentes. Las corrientes de Nav1.8 son mas lentas para inactivar que Nav1.7r-I1461T. independientemente de esto, las neuronas DRG cultivadas de rata tratadas con TTX que producen grandes corrientes endogenas de Nav1.8, pero sin corrientes recombinantes, no producen corrientes resurgentes ( N=11, ver complemento figura 1). Asi, otros factores deberian tambien contribuir a la inclinación de isoformas de VGSC especificos para generar corrientes resurgentes.

Los datos aquí presentados, en relacion con los hallazgos de nuestro estudio previo, muestran claramente que las neuronas DRG tienen el desarrollo celular apropiado para la producción de corrientes resurgentes. Por el contrario, las neuronas sensoriales adultas de DRG no son tejido natural para la expresión de Nav1.4 y Nav.1.5, y no se sabe si las celulas del musculo esquelético y cardiaco tienen el desarrollo celular apropiado para la producción de corrientes resurgentes.

Datos de las neuronas cerebelosas de Purkinje indican que la subunidad beta 4 de los canales de sodio auxiliares pueden ser el factor bloqueante crucial para la generacion de corrientes resurgentes con Nav1.6. previos trabajos han demostrado que neuronas DRG y miocitos esqueleticos y cardiacos, todos expresan altos niveles de beta 4. sin embargo, aunque la subunidad beta 4 pueda ser necesaria, esto no parece ser suficiente.
    La fosforilacion de los canales de sodio, de la subunidad beta 4, o posiblemente una proteina no identificada tambien parece ser necesario, al menos en las neuronas cerebelosas de Purkinje.
    Esto indica que cambios en la actividad fosfatasa o quinasa son probablemente lo que afecta la generacion de corrientes resurgentes.
    Por lo tanto, aun cuando las condiciones en el musculo esqueletico y cardiaco normal no sean apropiadas para la generacion de corrientes resurgentes, en especifico, posiblemente patologico, las condiciones, en que estas celulas puedan expresar las apropiadas subunidades y quinasas.
    Porque nuestro sistema de expresión optimizado usado en neuronas DRG adultas, en las cuales Nav1.4 y Nav1.5 no son normalmente expresadas, esto podria ser de gran intereses para determinar si Nav1.4 y Nav1.5 de tipo nativo y mutante producen corrientes de sodio resurgentes en el musculo esqueletico y cardiaco, específicamente, tanto bajo condiciones normales y como patologicas.

Es importante denotar que no todas las neuronas DRG expresan canales recombinantes capaces de generar corrientes resurgentes que sean detectables. Esto indica además que el ambiente celular es un determinante crucial de la producción de corrientes resurgentes.
Diferencias regionales en las propiedades de las fibras aferentes sensoriales que afectan la generacion de corrientes resurgentes podria contribuir a la asociación fenotipica del dolor con regiones particulares del cuerpo en PEPD. Curiosamente, las celulas que generan corrientes resurgentes detectables generalemente generan mas grandes Peak de corrientes transientes (tabla suplementaria 4). Aunque esta diferencia fue solo significativa para 3 de 7 canales que generaron corrientes resurgentes, esto puede sugerir que los factores celulares que subyacen la generacion de corrientes resurgentes podria tambien afectar la expresión del Peak de corrientes.

Sin embargo, mas de 40 celulas con amplitudes Peak de corrientes transientes de mas de 20 nA fueron registradas que carecian de corrientes resurgentes detectables. Por otra parte, la amplitud relativa de corrientes resurgentes es pobremente correlacionada con la amplitud Peak de corrientes transientes (figura suplementaria 3). En este momento, no sabemos como las neuronas DRG que producen y no producen corrientes resurgentes difieren en terminos de la expresión de subunidad beta y/o la actividad quinasa. Nuestro sistema de expresión optimizada DRG puede ser util en identificar factores celulares que modulan las corrientes resurgentes.

Nuestros datos muestran claramente que las corrientes de sodio resurgentes problablemente juegan un papel en las consecuencias funcionales de las canelopatias hereditarias neuronales y musculares.

Ademas, nuestro datos –en relacion con el estudio anterior indican que beta-pompilidotoxina puede inducir artificialmente corrientes resurgentes en las neuronas cerebelosas de Purkinje-, indican que cualquier manipulación que disminuya o desestabilize la inactivacion tiene el potencial de inducir corrientes resurgentes. Muchas modificaciones postranscripcionales han sido reportadas que disminuyen el rango de inactivacion o aumentan la amplitud de corrientes de sodio persistentes, incluyendo hipoxia, fosforilacion, señalizaciones de calcio alteradas, activacion de proteinas G, y oxidación. Postulamos que esas alteraciones podrian tambien resultar en la generacion anormal de corrientes resurgente. La inducción de corrientes resurgentes de sodio problablemente contribuye a los cambios electrofisiologicos mas extremos y secuelas que pueden ser asociadas con, tanto los desordenes heredados como adquiridos de la excitabilidad muscular y neuronal.

4.- METODOS

a)    Construcciones de canales de Sodio y Mutagenesis
Estos estudios usaron construcciones de cDNA que codifica Nav1.4 con estructura abierta de lectura, Nav1.5 del mismo tipo, Nav1.6 de ratones con las mismas caracteristicas, y Nav1.7 humanos.para ayudar al aislamiento y caracterizacion de las corientes de sodio generadas por las neuronas DRG por VGSC recombinantes, construcciones de cDNA de Nav1.4, Nav1.6 y Nav1.7 fueron modificados con una mutacion puntual unica para conferir alta resistencia a TTX (en lo sucesivo, Nav1.4r, Nav1.6r y Nav1.7r, respectivamente; Ki, a unos 100mM) usando XL QuikChange (Strata-gen) kit de mutagénesis, como se describio previamente. Los canales Nav1.5 son naturamente resistentes a TTX (Ki, alrededor 2 uM); por lo que sus sensibilidad a TTX no se modifico. Construcciones de canelopatias adicionales (Nav1.4r-R1448P, Nav1.5-F1486L, Nav1.6r-I1477T,  y Nav1.7r-I1461T) fueron hechas por inserciones de mutaciones respectivas en las construcciones de cDNA resistente a TTX usando el QuikChange XL kit de mutagénesis siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mutaciones fueron confirmadas por secuenciacion.

b)    Cultivo celular y transfección de cDNA
Neuronas DRG de ratas adultas fueron se cosecharon y cultivaron como se describio anteriormente. Los procedimientos con animales fueron aprobados por Instituto del cuidado animal de la escuela de medicina de la Universidad de Indiana y su comité. Brevemente, las ratas fueron entregadas inconcientes para la exposición a CO2 y decapitadas (entero brigidos, shiaaaaaaaaaa XD). Las celulas fueron tratadas con colagenasa (1mg/ml) y papaina (1mg/ml), disociadas en suplemento DMEM  con 10% de suero fetal bovino, y se vierten sobre un cubreobjetos cubiertos con poliornitina y laminina. Los cultivos se mantuvieron a 37°C en una incubadora de CO2 al 5%, y los medios se cambiaron cada 2 dias durante los periodos de incubacion experimental. El arma de helio gen (laboratorios Bio-Rad) fue usado para cotransfectar transitoriamente las neuronas DRG de ratas, como se describio anteriormente. Las celulas fueron cotransfectadas con un plasmido que codifica el VGSC recombinante y un ribosoma interno se pone en el sitio – EGFP (IRES-EGFP) del vector plasmido que tambien codifica a Nav1.8 shRNA (ver mas abajo para detalles).

c)    Electrofisiologia
Registros de DRG fueron obtenidos de celulas 20-72 horas después de la transfección. El registro de Patch-clamp de todas las celulas se llevo a cabo en el modo de voltage-clamp a temperatura ambiente (alrededor de 22°C) después de obtener un registro(sello) de giga-ohm (1-20 Gohm) usando un amplificador HEKA EPC-10. Datos fueron adquiridos en un computador Pentium IV en base a Windows usando el programa de pulso (version 8.65; HEKA electronica). Eletrodos de disparo fino (0.9-2-5 MOhm) fueron fabricados de 1.7 mm de cristal capilar usando un extractor de Sutter P-97 (Novato), y las puntas estaban cubiertas con cera pegajosa (KerrLab) para disminuir la capacitancia de los artefactos y aumentar la compensación de la resistencia en serie. La solución estándar consistió electrodo de 140 mM de CsF, 10 mM NaCl, 1,1 mM EGTA, y 10 mM HEPES. La solucion de baño extracelular estandar contenia 130 mM NaCl, 30 mM de cloruro de TEA, 1 mM de MgCl2, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, de 0,05 mm CdCl2, HEPES 10 mM y 10 mM de d-glucosa.

Los registros de las soluciones fueron ajustados usando d-glucosa para mantener los valores de pH fisiologico y la osmolaridad. Las celulas en el cubreobjetos fueron transferidas a una camara de registro conteniendo solucion de baño de 250ul. Las celulas transfectadas fueron seleccionadas en base a su habilidad para expresar EGFP. Las celulas que no expresaron EGFP fueron tambien usadas para experimentos de control de no transfección y analisis. Los protocolos de voltage-clamp fueron usado para ensayar las propiedades biofisicas de las corrientes de sodio recombinantes en presencia de 500 nM de TTX para knockear las corrientes de sodio sensibles a TTX. El potencial compensatorio fue puesto a 0 antes de parchar. La capacitancia de los artefactos fue cancelada usando el circuito controlado por computadora del amplificador de patch-clamp. Los errores de resistencia en serie fueron siempre compensados con 75%-90% de compensación de resistencia en serie y eran por lo general menos de 5mV durante los registros de voltage-clamp. Las corrientes de fugas fueron cancelados linealmente por sustracción digital P/-5, según el cual las corrientes evocadas por 5 pulsos que son una quinta parte del impulso de prueba se restan del pulso de prueba. Las celulas tenian un potencial de membrana de -100mV. Las corrientes de membrana fueron filtradas a 5KHz, mediante muestreo a 20 KHz. Todos los registros de las celulas parchadas no duraron mas de 45 minutos, y las celulas no estuvieron en la solucion de baño estandar por mas de 1 hora. Las corrientes de sodio de entrada tenian un potencial de inversion de aproximadamente  de +65 mV, que corresponde muy cercanamente al potencial calculado por la ecuación de Nerst observado durante el protocolo de voltage de corriente(I/V) estandar.
Los datos no fueron registrados antes de 3 minutos después de la configuración de célula completa, se había establecido dar tiempo suficiente al electrodo hasta que se estabilice. Una vez que comenzó la grabación, las células se sometieron a una serie de 60 pulsos de 20 ms cada uno a -10 mV, para garantizar en resumen cualquier corriente residual endogena Nav1.9. las relaciones I/V fueron determinadas por un protocolo de paso depolarizante incrementado, probando cada +5mV por 50 ms, de -80 a +50 mV. Para determinar la fraccion de canales que transcurren a un estado inactivado rapido, un protocolo de doble pulso (h∞/V) fue utilizado para que aumentara de forma acondicionada de -120 a -10 mV durante 500 ms antes probando la fraccion de canales disponibles a -10 mV. Las corrientes resurgentes fueron ensayadas con un protocolo de 2 pasos que inicialmente depolariza la membrana a +30 mV por 20 ms antes de probar las corrientes de sodio resurgentes de entrada por hiperpolarizacion del potencial de membrana en -5 mV en forma descendente de 0 a -80 mV, por 100 ms, después se volvio al potencial de reposo. Los datos experimentales de Voltage-clamp fueron analizados usando los programas Pulsefit (version 8.65; HEKA Elektronik), Origin (version 7.0; OriginLab Corp.), y Microsoft Excel software. Datos de las condiciones de estado estacionario individuales de registro fueron ajustados usando una distribución de fase unica estandar Boltzmann para activacion dependiente de voltaje (m∞) y datos de inactivacion rapida de estado estacionario (h∞). medio punto (V1/2) y los factores de la pendiente (Z) fueron calculados utilizando una única norma de la fase de distribución de Boltzmann ajuste según la ecuación 1.










d)    Cuantificacion y Analisis de las Corrientes Resurgentes de Sodio

Las celulas fueron ensayadas para la habilidad de producir corrientes de sodio resurgentes usando un protocolo de paso (Figura 2E) que inicialmente condiciona las celulas a +30 mV por 20 ms, de un potencial de reposo de -100 mV, antes se repolarizaro el potencial de membrana de 0 a -80 mV (en aumentos de -5mV) para probar las corrientes resurgentes; las celulas luego fueron vueltas a su potencial de reposo. Las corrientes de sodio resurgentes presentan caracteristicas distintas, y estas fueron usadas para determinar si una celula generaba corrientes resurgentes.

 Por ejemplo, las corrientes resurgentes muestran una unica voltaje dependencia en la cual el Peak de la corriente resurgente son evocadas por potencial relativo moderadamente hiperpolarizante para mantener el potencial durante la repolarizacion. Para todas las celulas identificadas con corriente resurgente en el estudio de corrientes, el maximo Peak de la corriente durante los pulsos repolarizantes fue producido con una ventana de potenciales de -35 a -50 mV (figura 2F) y se observaron primero alrededor de -10mV.  Ademas, estas corrientes muestran una unica cinetica de activacion con la ventana de potenciales con un inicio mucho mas lento y una fase de caida igual(mucho mas lenta). Esto esta en contraste con las corrientes finales clasicas de VGSC, la cuales se observan de forma instantanea tras los pasos hiperpolarizantes, y decaen en unos pocos milisegundos.

En aproximadamente el 50 % de las células, las corrientes resurgentes no fueron detectadas ( por ejemplo, ver las figuras 2, 4 y 6). Las corrientes fueron analizadas con la resta de las fugas en PulseFit y fueron filtradas a 1000 Hz para reduce el ruido pero mantener la onda de la corriente. La amplitud de la corriente resurgente fue la relativa medida por la linea base restado la fuga (figura suplementaria 2). La amplitud relativa de la corriente resurgente fue calculada como un porcentaje del Peak de la corriente transientes por multiplicando el Peak de la corriente resurgente por 100 y lego dividiendo por el Peak de la corriente transientes generada durante la prueba de pulso de -10 mV de un potencial de reposo de -100 mV. La amplitud de la corriente resurgiente promedio para cada construccion de VGSC fue solo calculada usando datos de esas celulas en las cuales las corrientes resurgentes fueron detectadas. Registros contaminados con corrientes resistentes a TTX endogenas, determinados de tramos de inactivacion de estado estacionario (ver mas abajo), no fueron usadas para mas analisis.  Las celulas que expresan corrientes recombinantes con Peak de amplitud de corrientes de sodio transientes que fueron menos de 5 nA fueron también excluidas de todo analisis debido a las  incertezas asociadas con la medicion de la amplitud de la corriente resurgente en celulas que tenian un pequeño Peak de amplitud de corriente.

e)    Aislamiento de corrientes recombinantes de VGSC en neuronas DRG
El objetivo de estos experimentos fue aislar y registrar las corrientes de sodio generado por el VGSCs recombinante. Como se describió anteriormente, los canales recombinante, o bien eran naturalmente resistentes (Nav1.5), o fueron mutados a ser resistentes (Nav1.4, Nav1.6, Nav1.7), a la TTX. Canales endogenos DRG sensibles a TTX fueron bloqueados con 500 nM de TTX. Neuronas DRG pueden también expresar corrientes Nav1.8 y Nav1.9 endogenas, las cuales son resistentes a TTX.

Corrientes Nav1.9 no se observan en los cultivos. Aunque  las corrientes Nav1.8 se vieron disminuidas en el cultivo,  se utilizaron  medidas adicionales para minimizar la contaminación de recuerdos Nav1.8 por las corrientes. corrientes Nav1.8 se daban de baja con un objetivo
plásmido ARNhc (pLL3.7; secuencia de selección de beneficiarios, GATGAGGTCGCTGCTAAGG)
el silencio a la expresión del gen de rata nativa NaV1.8 a través de RNAi (51). Además,
la ARNhc Nav1.8 fue en un vector de IRES-EGFP, permitiendo transfectadas
las células que se identifican por su fluorescencia verde. El plásmido shRNA y  canal de sodio construcciones recombinantes se transfectaron en una proporción de 2:1.  En condiciones de control (menos de 48 horas en la cultura), Nav1.8 actual  la amplitud promedio de 34,9 ± 4,8 nA (n = 42). Para determinar la eficiencia de  Nav1.8 caída ARNhc, las neuronas se transfectaron con TTX sensibles  Nav1.7 plásmido más el ARNhc Nav1.8. Las células con fluorescencia verde se
registrados en la presencia de TTX (para bloquear endógenos y recombinante  corrientes TTX sensibles en este experimento de control), y el restante  actual TTX resistente, que debe ser generada por endógena TTX resistente  canales, se midió (n = 17). Nav1.8 y Nav1.9 producir corrientes  un distintivo de propiedades cinéticas y dependiente de voltaje, que pueden ser fácilmente  distinguir unos de otros y de las corrientes TTX sensibles (10, 48).
En los 17 células examinadas, las corrientes Nav1.9 no fueron respetadas y la Nav1.8
la amplitud de corriente promedio de 0,5 ± 0,3 nA. Por lo tanto, las corrientes endógenas Nav1.8
se redujeron en un 98% mayor que en las condiciones experimentales
(Figura 1 consulta, A y B).

Además, debido a las corrientes Nav1.8  tienen diferentes propiedades cinéticas y el voltaje-dependientes, la contaminación  por Nav1.8 actual puede determinarse para cada celda individual que expresa  recombinante actual.

 El punto medio de la dependencia de voltaje de la inactivación  para Nav1.8 corrientes es -34,7 ± 2,0 mV, bastante más despolarizado  que cualquiera de las construcciones recombinantes investigado en el presente estudio  (Ver Tabla 1). El Análisis de la dependencia de voltaje de la curva de inactivación puede  por tanto, ser utilizado para determinar la amplitud absoluta y relativa de los recombinante y la actual VGSC Nav1.8 endógena en curso para cada  células individuales (Supplemental Figura 1C). Las células que expresaban Nav1.8 corrientes  con amplitudes mayores que el 15% de la amplitud de corriente recombinante  Se excluyeron del análisis de datos final. En las 150 células que expresan  VGSCs recombinante TTX resistente que se utilizaron en el análisis final, el  pico de la amplitud de corriente recombinante promedio 36,2 ± 2,1 nA, y el pico  Nav1.8 amplitud de corriente residual promedio de 0,3 nA. Es importante tener en cuenta  que las corrientes de sodio resurgimiento no se observaron en un grupo control de  neuronas transfectadas con siRNA Nav1.8 y tratados con TTX que no  expresa recombinante TTX resistente VGSC actual (n = 11; de consulta  Figura 1E). Por otra parte, en otro grupo de control de GRD de rata en cultivo neuronas tratadas con TTX que produjo grandes corrientes Nav1.8 endógena (Amplitud de punta media, 32 ± 8 nA, n = 11), las corrientes se resurgimiento no se observó (Supplemental Figura 1D).

Estos datos confirman que (a) la uso de TTX y la ARNhc Nav1.8 permite un aislamiento eficaz de la corriente producido por VGSCs recombinante en las neuronas DRG transfectadas y (b) la
corrientes registraron resurgimiento de DRG neuronas transfectadas con Nav1.8  shRNA y canales recombinante TTX-resistentes en la presencia de 500  nM TTX de hecho se generaron por la vía recombinante.

f)    simulaciones computacionales
Las simulaciones fueron realizadas para explorar el impacto que las corrientes resurgimiento
generados por VGSCs y mutantes de la enfermedad pueda tener en la cocción de AP. El
enfoque básico consistía en utilizar los modelos establecidos de neurona GRD y cardíaca
excitabilidad de los miocitos que se habían aplicado en la simulación NEURON  medio ambiente (17) y, con las modificaciones sólo en la adecuada la formulación de los canales de sodio, simular y evaluar el impacto de la enfermedad mutación y / o el resurgimiento del factor de bloqueo actual. 

g)    DRG de simulación de neuronas
El modelo de neurona DRG utilizado fue desarrollado previamente (16) e incluía
las siguientes corrientes dependientes de voltaje: un rectificador de potasio retraso
actual (IKDR), una corriente de potasio de tipo A (IKA), y Nav1.8, lentamente inactivar
TTX-R actual. Las únicas modificaciones introducidas en el modelo fueron a la
Nav1.7 corriente de sodio voltaje-dependientes en el modelo. La corriente de sodio
cambios se aplicaron en un modelo de Markov basado en el Hodgkin
formulación de Huxley Nav1.7 utilizado anteriormente (16).

La formulación de Markov es más susceptible de aplicación tanto de los efectos I1461T  y el factor de resurgimiento de bloqueo (18). Las simulaciones se realizaron con (a) 100%  Nav1.7, (b) 100% Nav1.7 con el resurgimiento actual, (c) 50% y 50% Nav1.7  Nav1.7-I1461T, y (d) 50% y 50% Nav1.7 Nav1.7 I1461T-, ambos con  el resurgimiento actual. canales mutantes se simularon con el 50% de canales tipo salvaje es porque las mutaciones PEPD muestran dominancia autosómica.

Nav1.7. El diagrama para el modelo de Markov utilizado para la simulación de tensión-
conductancias cerrada de sodio se muestra en la Figura 3A. El modelo incluye  3 estados cerrados, un estado de conducción abierta, y 3 estados inactivada. El Markov  modelo utilizado para la simulación de la conductancia de sodio dependiente de voltaje con  resurgimiento actual incluye 1 estatales adicionales, el estado bloqueado abierto (Figura  3A región, en caja). El factor actual resurgimiento se implementó como  hecho para la simulación de corrientes resurgiendo en las neuronas de Purkinje del cerebelo  por Khaliq et al. (18), con ligeras modificaciones a las expresiones de la tasa de transición  (Véase el cuadro de consulta 2).
Nav1.7-I1461T. C

aracterización del impacto funcional de la I1461T  mutación en células HEK293 (13) y las neuronas DRG (estudio) mostraron  que esta mutación desestabilizado inactivación, desplazando la dependencia de voltaje  de la inactivación en la dirección de despolarización y ralentizar el ritmo de  abierta estado de inactivación. Los valores medidos de la disponibilidad de canales y constantes de tiempo de inactivación de estos estudios se utilizaron para la reformulación de expresiones para las transiciones verticales en la figura 3a (entre el inactivada  los estados y los estados cerrado y abierto). Las transiciones horizontales  se mantuvieron sin cambios (Supplemental Cuadro 2). Figura 3B se compara el modelo  Nav1.7 y corrientes Nav1.7-I1461T suscitado con la despolarización un paso para  10 mV. El resurgimiento actual fue introducido en la conductancia Nav1.7-I1461T  modelo en la forma exacta en que se agregó a la de tipo salvaje Nav1.7 conductancia modelo. Figura 3C compara las corrientes generadas resurgimiento por Nav1.7and conductancias simulada Nav1.7-I1461T.  Miocitos cardíacos de simulación

Hemos modificado los modelos matemáticos de cocción AP cardíaca (20, 52) para simular el impacto de la mutación F1486L LQT3/SIDS y corrientes resurgimiento.  El modelo de los cardiomiocitos (véase http://senselab.med.yale.edu/ModelDB/  ShowModel.asp? Model = 3800) fue previamente establecida por I. Jacobson en el entorno de simulación NEURON (17). Los únicos cambios realizados a la modelo fueron a la corriente de sodio dependiente de voltaje (Naf en el
modelo original). Las simulaciones se realizaron con (un Nav1.5) 100%, (b) 100% Nav1.5 con el resurgimiento actual, (c) Nav1.5 50% y 50% Nav1.5 F1486L, y (d) Nav1.5 50% y 50% Nav1.5 F1486L-, ambos con el resurgimiento actual. canales mutantes fueron simuladas en los canales con 50% de tipo salvaje, porque las mutaciones LQT3/SIDS muestran dominancia autosómica.


Nav1.5. Hemos desarrollado un modelo de Markov basado en el de Hodgkin y Huxley
formulación de Nav1.5 en el modelo original (20, 52). La formulación de Markov era más susceptible de aplicación tanto de los efectos F1486L y el factor de resurgimiento de bloqueo. estados intermedios inactivación se no incluidos en esta fórmula, que no estaba claro cómo el modelo de potencial interacciones entre el factor de resurgimiento actual de bloqueo e intermedios estados de inactivación. Esto es razonable, ya que la mutación puede F1486L
tienen poco o ningún impacto sobre la inactivación intermedia (19). El diagrama para
el modelo de Markov utilizado para simular las conductancias de sodio dependiente de voltaje
se muestra en la Figura 3A, y las expresiones de velocidad de transición para Nav1.5
se proporcionan en la consulta la Tabla 3. Nav1.5 F1486L.
Nuestros datos sobre la mutación F1486L indicar que se produce desestabilización moderado de inactivación, desplazando la dependencia de voltaje de la inactivación por aproximadamente 8 mV en la dirección de despolarización, disminuyendo la velocidad de inactivación, y un ligero aumento de las corrientes persistentes.

Modelamos estos efectos mediante la alteración de las tasas de transición desde la posición cerrada y el estado abierta a los estados inactivado (véase el cuadro de consulta 3). Simulado
Nav1.5 y corrientes Nav1.5-F1486L se muestran en la Figura 5A.  Nav1.5 y Nav1.5 F1486L con el resurgimiento actual. El resurgimiento actual factor fue el modelo a ser similar a la de Nav1.7, pero con ligeras modificaciones a la expresión general para explicar la relativa resurgimiento
la amplitud de corriente observada con Nav1.5 y canales Nav1.5-F1486L en nuestros experimentos (Supplemental Cuadro 3). Simulación de corrientes están resurgiendo se muestra en la Figura 5B.


Estadística
Todos los datos son media ± SEM. Comparación de la frecuencia se determina mediante
prueba de χ2. La significación estadística se evaluó con Microsoft Excel que utiliza
Estudiantes 2-cola de prueba de la t no apareado. La significación estadística de la diferencia fue
acepta valores de p menor de 0,05.


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