Antecedentes: La eritropoyetina es un factor de crecimiento de uso general manejar anemia en pacientes con enfermedad de riñón crónica. Un desafío clínico significativo es la resistencia relativa a la eritropoyetina, producto del uso de dosis sucesivamente más altas de esta, para poder  alcanzar niveles buscados de hemoglobina, y al riesgo creciente de resultados adversos.

La eritropoyetina actúa a través del receptor de la eritropoyetina (EpoR) en eritroblastos. Alternativamente el splicing del RNAm produce una forma soluble de EpoR (sEpoR) encontrada en sangre humana, no obstante su papel en anemia no se sabe.

El dato: La eritropoyetina o EPO es una hormona que estimula la formación de eritrocitos. En los seres humanos, es producida principalmente por el riñón (90%),La eritropoyetina actúa cuando se une a un receptor celular específico (EpoR). La producción de eritropoyetina es estimulada por la reducción de tensión de oxígeno en los tejidos (hipoxia tisular). En la resistencia a la eritropoyetina la medula osea deja de responder a la EPO, pese a que se sisntetizan cantidades de EPO cada vez  mayores.


Métodos y resultados: Usando las muestras archivadas del suero obtenidas en personas con enfermedad renal en etapa final, demostramos que  sEpoR es perceptible como una proteína 27kDa y que niveles más altos del sEpoR del suero se correlacionan con requisitos crecientes de la eritropoyetina.

    EpoR soluble inhibe la eritropoyetina mediante una señal  transductora y  activadora de la fosforilación de la factor de transcripción 5 (Stat5,  un clasico factor de transcripción) en las variedades de células que expresan EpoR.
    Importantemente, demostramos que el suero de pacientes con los niveles elevados del sEpoR bloquea esta fosforilación en los ex estudios de vivo.
    Finalmente, demostramos que el sEpoR es aumentado en una variedad de células humana del eritroleucemia cuando es estimulado por mediadores inflamatorios tales como interleukin-6 y el factor de necrosis tumaral alfa (TNFalfa) que implican un acoplamiento entre la inflamación y la resistencia de la eritropoyetina.

Conclusiones: Estas observaciones sugieren que los niveles del sEpoR puedan contribuir a la resistencia de la eritropoyetina en enfermedad renal de  etapa final, y que la producción del sEpoR se puede mediar por citoquinas inflamatorios.

Por tanto si dejo de producir citoquinas inflamatoria habrán menos Epor solubles, y con ello menos resistencia a la eritropoyetina


1.- INTRODUCCIÓN
El manejo de la anemia con eritropoyetina en pacientes con la falla renal en diálisis ha cambiado perceptiblemente en nefrología. El uso clínico extenso de  eritropoyetina recombinante ha reducido las transfusiones de sangre y se ha asociado a la mejora de la hipertrofia ventricular izquierda, mejorando la calidad de vida en los pacientes de diálisis. Sin embargo, recientemente los estudios clínicos, han sugerido un exceso de acontecimientos cardiovasculares en los pacientes que requieren dosis elevadas de la eritropoyetina y una tendencia hacia exceso de mortalidad en pacientes de diálisis con cifras altas de hemoglobina blanco.
•    No está claro si es este exceso de mortalidad esta relacionado con la dosis de la eritropoyetina o una subida de la concentración de hemoglobina.
•    Consecuentemente hay discusión significativo sobre las dosis óptimas de eritropoyetina y cifras diana de la hemoglobina. Sin embargo, la terapia de la eritropoyetina todavía sigue siendo una piedra angular en la anemia en pacientes de diálisis crónicos.

La eritropoyetina es una hormona proteíca producida por el riñón en respuesta a la hipoxia. La eritropoyetina se une  al receptor de membrana de la eritropoyetina (EpoR) situado en eritroblastos en la médula. Después de la unión al receptor intracelular, una cascada de  señalización lleva a la transcripción de genes anti-apoptoticos. Esto da lugar a la producción de nuevos glóbulos rojos y mejora en anemia.
   
Entonces cuando la eritropoyetina interactúa con su receptor hace que el eritroblasto madure a eritrocito

a.    Sobre la resistencia a la eritropoyetina

Mientras que la mayoría de los pacientes responden bien a la eritropoyetina, un subconjunto de pacientes se considera resistente a eritropoyetina, requiriendo dosis 25-100%  más altas que el paciente promedio para mantener los niveles aceptables de la hemoglobina. Esta carencia de respuesta llamada  resistencia a la eritropoyetina o hiper responsibidad a la eritropoyetina  es multifactorial pero se puede relacionar con almacenes del hierro (absoluto y eficaz), osteodistrofia renal, e inflamación.

Generalmente pacientes quienes reciben dosis superiores a 400 IU/kg por la semana de la eritropoyetina y tiene fallas para convertir hemoglobina diana, se consideran resistentes aunque haya claramente a espectro de la sensibilidad de la eritropoyetina. Permanece el desafiar clínico de predecir exactamente qué pacientes son resistente a la eritropoyetina antes de iniciar terapia de la eritropoyetina.

La inflamación crónica parece desempeñar un papel en algunos pacientes y hay evidencie que los cytokines inflamatorios pueden regular hacia abajo la respuesta de la médula a la eritropoyetina En tales casos puede haber deficiencia de hierro funcional relacionada con la entrega inadecuada de hierro a la medula eritroide en lugar de hacerlo al sistema reticuloendotelial.

La entrega del hierro puede ser inhibida por cytokines y hormonas inflamatorios tales como hepcidina que puede desempeñar un papel en la anemia renal. Además, marcadores de la eritropoyesis tal como el receptor soluble de la transferrina (sTfR) puede sea útil en la determinación de estrategias de administración apropiadas del hierro.

b.    Características de EpoR y EpoR soluble
EpoR es el receptor de membrana presente en eritroblastos  y es una citoquina miembro de la superfamilia proteínas de la transmembrana del tipo 1.  La unión de la eritropoyetina al receptor tiene como resultado  la fosforilación de mensajeros intracelulares tales como Stat-5 que une los residuos de la tirosina, hace fosforilacion y desplace al núcleo para iniciar la transcripción del genes. Otra cascada de la señalización intracelular se pueden activar también incluyendo phosphoinositidecinasa 3, cinasa de IkappaB, y proteína 70 que lleva a la transcripción de los factores de transcripción antis-apoptotic .

Importantemente, alternativas del splicing del ARNm produce una forma soluble de Epor (sEpoR) que está presente en la sangre humana. EpoR soluble consiste solo en el dominio extracelular y posee un peso molecular entre del kDa 27 y 34 con diferencias relacionadas a la glycosilacion, ya que algunas de la proteínas del sEpoR no tenga purificado del suero u ordenado. Otra posibilidad
es que haya más de una forma del sEpoR de circulación, pues se ha identificado en más de una variante del splicing.

La función del sEpoR es desconocida, pero sus niveles se correlacionan con la cantidad de eritropoyesis, mencionando la posibilidad de un papel fisiológico de este receptor soluble. EpoR soluble se ha identificado en suero y plasma humanos así como en numerosos  tejidos incluyendo el cerebro, hígado, bazo, riñón, corazón y médula. También se ha identificado como producto secretado  de varias variedades de células del cáncer.

•    Es bien sabido que los receptores solubles desempeñan un papel importante en la señalización del cytokine estabilizando su ligando, o alterando la interacción entre el cytokine endógeno y ligando de la membrana

•    Aunque se haya demostrado que el sEpoR secretado puede unir la eritropoyetina, el papel del sEpoR de circulación en seres humanos sigue siendo en gran parte desconocido.

•     Presumimos que el sEpoR de circulación compite por la unión la eritropoyetina y que elevados  niveles del sEpoR en la iniciación de la hemodialisis incrementen las dosis necesarias de eritropoyetina requeridas para sostener niveles de la hemoglobina blanco. Además presumimos que la producción del sEpoR puede sermediado por cytokines inflamatorios presente en el entorno urémico

Mi conclusión: Con esto se explicaría la resistencia a la eritropoteina, ya que si citoquinas inflamatoria permiten mayor circulación del sEpoR, y este compite  por unirse a la eritropoyetina, es necesario que se produzca mas Epo por parte del riñón para alcanzar niveles adecuados de eritrocitos.








2.- MATERIALES Y MÉTODOS
1.    Inmunoprecipitación
    Muestras humanas del suero de sujetos de ESRD (aproximadamente 1 ml) fue mezclado en un cociente del 1:1 con el almacenador intermediario de la lisis del IP (150 milímetros de NaCl, 10 milímetros Tris pH 7.5, EDTA de 1 milímetro, 50 nanómetro NaF, 1Triton X, 0.5 NP40, Na Orthovanadate 200 milímetros, PMSF 10 mg/ml, inhibidor de proteasa e inhibidor de la fosfatasa en 4uC.
    Anticuerpo primario dirigido contra EpoR (R& Sistemas de D, policlonal de la cabra de AF-322-PB o R&amp anti-humano; Los sistemas de D, monoclonal antihuman del ratón MAB307 (aproximadamente 0.5 mg/reaction) fueron agregados a cada tubo e incubado durante noche en 4°C.
    Ocurrió  precipitación con la proteína G cubierto de granos magnéticos, con lo que después la proteína fue granulada y lo que flota sin unirse a ella del fue desechado.
    Los granos fueron lavados tres veces con el almacenador intermediario de la lisis. Las proteínas de alrededor fueron enjuagadas con el almacenador intermediario del cargamento 2X (almacenador intermediario reducción de 4x de la SDS-muestra de Laemmli, Boston BioProducts No. BP-110R) según las recomendaciones del fabricante.
    Lo que flotaba del precipitado, supernatans, fue conservado y los granos se desecharon. Igual las cantidades de proteínas enjuagadas fueron separadas en un gel del gradiente de la acrilamida 4 - 12. La proteína fue transferida a PDVF usando una transferencia semiseca y western blotting performed se realizó usando los dos anticuerpos de EpoR en las concentraciones de 1/1.000 (R& Monoclonal anti-humano de los sistemas, del ratón MAB307 o R&amp de D; Sistemas de D, AF-policlonal anti-humano de la cabra 322-PB)

En resumen en el suero de los pacientes pusieron anticuerpos contra Epor, que se unieron según afinidad al receptor, luego enjuagaron  para asegurar que fuera una muestra confiable. Las proteínas encontradas, en este caso el recetor, se hizo pasar por un gel de acrilamida,  y relazaron transferencia seca y western blotting a ambos anticuerpos, para que  por medio de los anticuerpos os investigadores pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos.

2.    Secuencia de proteínas /espectrometría de masas
    La inmunoprecipitación fue realizada como se describe anteriormente con la excepción que 30 ml de suero reunido de sujetos urémicos. Desnaturalizando los geles de la acrilamida fueron manchados con 0.1 % Azul brillante de Coomassie.
    Una banda del tamaño apropiado y una sección del gel para el control negativo fueron cortadas y aclaradas en 1% acetonitrilo. Los fragmentos del gel estaban conforme al resumen de la tripsina y a la espectrometría total en la base del proteomics de la diaconisa de Beth Israel laboratorio. Brevemente, las muestras fueron tratadas con la tripsina (1: 100) y suspendido de nuevo en 1 ácido trifluoracético e inyectado le en una cromatografía líquida del alto rendimiento de CapLC
    Los péptidos fueron separados usando 75 milímetros nanos  y analizados usando un sistema de Qstar XL MS/MS. Los péptidos fueron buscados usando la Search Engine (ciencia de la matriz) contra la proteína humana base de datos NCBInr.

Entonces luego de identificar las proteínas prosiguieron a secuenciarlas a través de la espectrometría de masas que permite identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto

3.    sEpoR ELISA
    La prueba de ELISA de las muestras del suero y de los supernatants (flotante) del cultivo celular fue realizada usando un receptor DuoSet ELISA de la eritropoyetina (DY307, R& Sistemas de D, Minneapolis, manganeso).
    En el día del análisis de ELISA, el suero congelado o las muestras flotantes del cultivo celular fue deshelado en la temperatura ambiente y el suero de 100 ml (100) era agregado a cada uno
    Una curva estándar fue generada usando dilusiones seriales del sEpoR recombinante (R& Sistemas 307-ER/CF de D) en las concentraciones que se extienden a partir de 4 ng/ml a 62.5 pg/ml en diluyente el reactivo (1BSA/Phosphate protegió salino, R& Sistemas de DDY995). Todas las reacciones fueron realizadas en la temperatura ambiente.
    Las placas estuvieron cubiertas durante la noche con el Anticuerpo primario antihumano  de ratón contra   EpoR en PBS 1 mg/ml (100 ml/well).
    En el día del análisis cada uno fue lavado bien tres veces con el almacenador intermediario  (0.05 tweenes 20/Phosphate protegieron salino, R& Sistemas WA126 de D) 400 ml/well usando una favorable arandela de Columbus (Tecan, inc.). El diluyente el reactivo 300 ml/well fue agregado y las placas fueron incubadas para 1 hora.
    Las placas entonces fueron lavadas tres veces con el almacenador intermediario y el estándar o la muestra de 100 ml fue agregado a cada uno bien. Las placas fueron incubadas por 4 horas en una coctelera de la tapa de tabla y lavadas tres veces con el almacenador intermediario de la colada de 400 ml/well. El anticuerpo antihuman biotinylated secundario 500 ng/ml (100 ml/well) de EpoR del ratón fue agregado y las placas fueron incubadas por 2 horas en una coctelera de la tapa de tabla.
    Las placas fueron lavadas otra vez con el almacenador intermediario de la colada tres veces y Streptavidin conjugado a la Rábano-Peroxidasa (100 ml/well) fue agregado por 20 minutos. Las placas fueron lavadas tres veces en almacenador intermediario de la colada y el reactivo del color que contenía H202 y el tetramethylbenzidine (100 ml bien) fue agregado (R& Sistemas DY993 de D). Las placas fueron incubadas por 20 minutos y paran la solución 2N H2S04 50 ml (R& Los sistemas DY994 de D) fueron agregados a cada uno bien.
    La densidad óptica fue medida usando un lector de Microplate (BioRad, modelo 660). La densidad óptica en 550 nanómetro fue restada de densidad óptica en 450 nanómetro y las concentraciones del suero eran resueltas usando una curva estándar generado por un diagrama cuadrático de las concentraciones de la muestra estándar contra la densidad óptica medida. Rodamos el análisis duplique para todas las muestras a excepción de 18 muestras del suero que fueron medidas solamente una vez mientras que la muestra nos limitamos volumen. Cegaron al operador a los datos clínicos.

Los anticuerpos usados en el R& Los sistemas DuoSet ELISA de D tienen epitopos propietarios que apuntan la región extracelular del receptor (AA 25 a 225). El ELISA podía detectar dos sEpoRs recombinantes alternativos además del sEpoR usado para generar la curva estándar. Calculábamos intra y coeficientes del inter-análisis de la variación usando funcionamiento de 3 muestras del suero en triplicado en tres placas separadas. En intra análisis el coeficiente medio de la variación para las tres muestras era la gama 4.71(1.10 a 9.49) y el coeficiente inter medio del análisis de la variación era la gama 4.74 (1.20 a 9.27). La técnica de elisa o  Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, es útil porque se  basa en la especificidad del reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.

También probamos la interferencia de la eritropoyetina clavando (uniendo) el suero y el control con la eritropoyetina recombinante hasta 10.000 mU/ml y no observó ninguna alteración significativa en las medidas de EpoR sugerir el análisis mide el sEpoR total algo que libremente sEpoR.

Análisis de la señalización de BaF3/EpoR Stat-5 Las células de BaF3/EpoR que expresaban estable el receptor de EpoR eran obtenido del Dr. Laurie Feldman, diaconisa de Beth Israel médica Centro [35.36]. Las células fueron plateadas en 500.000 células por bien en un 24 plato bien y crecido durante la noche en RPMI con 1 FCS. Los medios eran substituido por medios sin suero e incubado por 12 horas. Vehículo, eritropoyetina recombinante (Amgen), suero humano, y receptor recombinante (R& Los sistemas de D) fueron agregados a los pozos a un total volumen de 500 ml (suero de 50 ml por pozo) con la eritropoyetina 50 MU ml y receptor recombinante. Las células fueron incubadas por 10 minutos en 37u, y lysed inmediatamente en almacenador intermediario de RIPA con la proteasa inhibidores y muestras congelados en 280uC para el análisis adicional cerca manchas blancas /negras occidentales usando los anticuerpos phospho-Stat-5 y Stat-5 (Stat-5 anticuerpo (No. 9363), phospho-Stat-5, Thyr694, anticuerpo (No. 9351) ambos de la tecnología de la señalización de la célula, Danvers mA.

c.    CONSIDERACIONES ESTADÍSTICAS PARA LOS DATOS IN VITRO
El análisis estadístico estándar fue realizado en todos los datos. Los valores individuales fueron compaginados como +/- de S.E.M. la comparación los grupos múltiples estaban al lado de una prueba de dos vías de ANOVA seguida por a prueba no paramétrica de Mann-Whitney o una prueba apareada de t cuando fue apropiado. La significación estadística era considerada si p, 0.05.

Que pi este al 0.05 la probabilidad de replicación está en torno al 50%, lo cual no se considera muy confiable  http://www.psicothema.com/psicothema.asp?id=594


d.    TEMAS HUMANOS

Para probar si los niveles de sEpoR influían en la iniciación de la hemodiálisis crónica se correlacionaron con la eritropoyetina requerida, fueron seleccionados pacientes con hemodialisis crónica CHD y pacientes con reemplazo renal de  mortalidad acelerada (ArMORR). Este estudio fue aprobado por el institucional Comité examinador del Hospital General de Massachusetts y el consentimiento informado fue revisado por el comité examinador institucional donde se archivaron las muestras fueron utilizadas en este estudio.

ArMORR incluye a 10.044 sujetos que iniciaron CHD en uno de los 1056 centros de diálisis de los E.E.U.U. que recibieron asistencia médica de Fresenius Norteamérica (Waltham, mA) entre 2004 y 2005. Todo los sujetos del experimento recibieron al año una carta recordativa a excepción de las que murieron(15%), recibieron el trasplante del riñón (#), función renal recuperada (4#), o que se cambiaron  a una unidad de la diálisis fuera del Fresenius antes de terminar 1 año de tratamiento de hemodiálisis.

Dentro de este grupo tuvimos entre 500-1000 pacientes con adecuada muestras de sangre consecutivamente y que sobrevivieron por lo menos 6 meses para examinar requerimientos de la eritropoyetina durante esto plazo.
•    Este tamaño de muestra fue elegido se basó en nuestro anterior estudio que examinan los niveles basales de otros parámetros y donde obtuvimos buenos resultados y porque ningún dato humanos anteriores estaba disponible para nosotros en cuanto a una estimación del tamaño del efecto y del tamaño de muestra para alcanzar resultados adecuada.
•    De éstos, 697 sujetos los que representaban sobre 400 unidades de CHD en los E.E.U.U. tenían muestras adecuadas con volúmenes basales normales con completo información de dosificación de la eritropoyetina (cantidad de eritropoyetina administrado en cada sesión de la diálisis).
•    Específicamente, a cada sujeto se le hizo tomar una muestra de sangre  dentro de 14 días de iniciar CHD y cada sujeto que era nuevo en el CHD. Ningún sujeto había experimentado nunca CHD o la diálisis peritoneal en el pasado, y ningún sujeto tenían un trasplante renal antes de la inscripción, como tampoco tenían función renal recuperada durante el período del estudio.
•    Medimos los niveles del sEpoR con análisis de ELISA y el diagrama de la distribución sugirieron que aproximadamente 5% de los sujetos de ESRD tenían altos niveles de EpoR en la sangre (>2 desviación estándar del medio).

Nosotros por lo tanto dividimos a los 697 pacientes en dos grupos basados en los niveles de sEpoRal principio de CHD:
o    El grupo del sEpoR con niveles altos tenia el sEpoR   >800 pg/ml (n= 36),
o    el grupo con niveles bajo del sEpoR (n =661) incluyó el resto.


e.    CONSIDERACIONES ESTADÍSTICAS PARA EL ESTUDIO CLÍNICO
Continuamente las variables fueron examinadas usando pruebas univariantes estándar para la comparación. El análisis longitudinal fue utilizado para probar las diferencias del grupo (sEpoR bajo contra alto) en un cierto plazo. La dosis acumulativa de la eritropoyetina fue categorizada como sigue:
•    Media dosis semanal administrada entre los días 0 y 14 (14d) después de iniciar CHD;
•    Media dosis semanal administrada entre los días 14 y 90 (90d);
•    y media dosis semanal administrada entre los días 90 y 180 (180d).
•    Los niveles medios de la hemoglobina fueron categorizados en una manera similar.

Realizamos las medidas repetidas ANOVA en examine en y entre ambos  grupo del sEpoR comparados. La interacción entre el tiempo y el estado del grupo del sEpoR fue probada para determinar si la relación de los requerimientos de la eritropoyetina y niveles de la hemoglobina  se diferenciaba entre los grupos en un cierto plazo.

Los análisis de regresión logística y linear fueron utilizados para ajustar factores de confusión potenciales. Todos los análisis fueron realizados usando la versión 9.1 del SAS para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, los E.E.U.U.). Los valores bilaterales de P, 0.05 eran considerados estadístico significativos.

   
f.    CULTIVO CELULAR, ESTÍMULO DE LAS CÉLULAS K562 Y ANÁLISIS DEL sEpoR EN SUPERNATANTS (Supernatants = lo que flota en un sedimento)

Las células K562 (ATCC, Virginia, CCL-243) fueron mantenidas dentro El FCS de los medios +10% de IMDM,  fueron puesta 500.000 células en de 12 placas sin suero.
En el tiempo cero las células fueron expuestas a:
•    éster del phorbol  500 nanómetro y a 1000 nanómetro,
•    TNF-a 50 ng/ml,  IL 6 10 ng/ml, IL-8 10 ng/ml, en triplicaicones por 48 horas.

En el final de 48 horas de células formaron pelotitas (pelleted), me imagino que porque decantaron a la temperatura de 4°C. las partículas flotantes (supernatans), fue recogido y almacenado en 280°C. EpoR ELISA fue realizado en los supernatants como se describe anteriormente. El análisis de la proteína fue realizado como sigue usando el análisis de la proteína de BCA (Pierce, Fisher termo científico, Rockford IL) según el protocolo estándar del fabricante.


•    NIVELES IL-6

Se midieron las IL-6 del suero usando un kit de elisa disponible en el comercio y las instrucciones del fabricante fueron seguidas. Los 32 sujetos con el sEpoR alto (>800 pg/ml) que y un número igual de sujetos aleatoriamente elegidos con el sEpoR bajo (<62.5 pg/ml) era incluido para este sub estudio. Los datos se representan como niveles medios de IL-6 en pg/ml +/- S.E.M para ambos grupos.

IL-6 Es una citoquina pro y anti inflamatoria con acción  Pirógeno, síntesis de Ig, y  Activación de la síntesis de de proteínas de fase aguda


3.- RESULTADOS

a)    EL sEpoR ESTÁ PRESENTE EN EL SUERO DE LOS PACIENTES DE DIÁLISIS

Intentamos inicialmente caracterizar el sEpoR en suero urémico usando dos anticuerpos diferentes  con western blot y no se pudo detectar una banda especifica que se correlacionara con el tamaño previsto del sEpoR. Sin embargo, la inmunoprecipitación con el receptor anti-humano de la eritropoyetina seguido por western blotting con el receptor anti-humano de la eritropoyetina del ratón reveló una banda clara de kDa aproximadamente 27 constante con el tamaño previsto del sEpoR en 6 muestras representativas del paciente de diálisis (figura 1a).

Una banda de el tamaño similar también fue detectado con inmunoprecipitación y el western blotting fue realizado con los mismos anticuerpos pero en orden reversa (figura 1b).

La Purificación de la proteína de 27 kDA de los sueros desujetos y del análisis urémicos por espectrometría total revelaron por lo menos 2  péptidos distitnos (GPEELLCFTERL y YEVDVSAGNGAGSVQR) que corresponde al N-terminal región extracelular del EpoR. Tomado juntos los estudios de immunoprecipation (figura 1a, 1b), estos datos sugiere que sujetos con  diálisis tienen  sEpoR en su suero.

Cuadro 1. caracterización del sEpoR en suero urémico.

1a. EpoR soluble es perceptible en suero de pacientes de diálisis por western blot.
El suero humano fue expuesto a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-humano del receptor de la eritropoyetina de cabra seguido por  western blotting  con el receptor monoclonal anti-humano de la eritropoyetina del ratón. Ambos anticuerpos reconocen el dominio extracelular de el receptor. Las líneas 1-6 son sueros  de 6 pacientes de diálisis representativos, la linea 7 son en blanco y la linea 8 es sEpoR recombinante. Se demuestro asi la existencia de una banda de peso molecular de 27 kDa aproximadamente. El sEpoR del control con la etiqueta de Fc es consecuente con lo divulgado por los fabricantes, que proponen un peso molecular del kDa 32

Entonces el suero humano fue expuesto a inmunoprecipitacion con anticuerpo contra EPO de cabra y luego se hizo un western blottingcon el receptor  de Epo pero de raton. Como los westen blott separan por peso molecular   vieron que la mayor cantidad de bandas estaba a los 27 Kda

1b. EpoR soluble también se detecta usando las mismas muestras del suero del paciente de diálisis pero ejecutando la inmunoprecipitación en orden reversa. En este experimento la inmunoprecipitación fue hecha con receptores monoclonales  anti-humano de eritrpopoyetina de ratón seguido por western blotting con el receptor anti-humano de la eritropoyetina  de cabra. Las líneas 1 a 3 son suero de 3 pacientes de diálisis, y la línea 4 es sEpoR-Fc recombinante como control positivo.

Para comprobar sus resultados en cuanto al peso molecular hiceron lo mismo pero en orden inverso, primero usaron inmunopresipitacion con los receptores de Epo del raton y luego western blot con los receptores de Epo de cabra. El resultado fue el mismo.










b)    LOS NIVELES ELEVADOS DEL sEPOR EN LA INICIACIÓN DE LA DIÁLISIS PREDICEN DOSIS DE LA ERITROPOYETINA EN AUMENTO
Medimos niveles del sEpoR por ELISA en grupo representativo de 697 pacientes de diálisis. La distribución de los niveles del sEpoR es demostrado en la figura 2a.

La mayor parte de los pacientes tenían niveles bajos del sEpoR (inferior o igual 100 pg/ml). Sin embargo, un subconjunto de pacientes mostro valores perceptiblemente elevados. El diagrama de la distribución sugerido es aproximadamente 5-6 % de sujetos con enfermedad renal de la fase final (ESRD) tenía niveles de circulación altos de EpoR (>2 estándar las desviaciones del medio.

Los sujetos fueron divididos de acuerdo a  niveles medios de sEpoR en su iniciación como pacientes  crónico de hemodiálisis. Asi fueron dividios como:
•    243761299 pg/ml en el  grupo alto (n= 36)
•    1126111 pg/ml en el grupo bajo (n= 661) (p, 0.001).
•    Los valores medianos eran 2147 pg/ml (gama inter-guartile 1400-3445) y 69 pg/ml (gama intercuartil 62.5-101), respectivamente.




Figura 2. Relación de la dosificación del sEpoR y de la eritropoyetina en humanos de ESRD.
2a. Esta figura demuestra la distribución de los niveles del sEpoR según lo medido por ELISA en nuestra muestra de 697 pacientes de diálisis.

 2b. Dosis de la eritropoyetina en un cierto plazo para los grupos bajos y altos del sEpoR.
•    La dosis de la eritropoyetina al principio de la diálisis (días 0  a 14) estaba igual en ambos grupos, 17.908 IU/week en el  grupo alto de sEpoR contra 18.851 IU/week en el grupo bajo del sEpoR.
•    Entre los días 14 y 90 el grupo alto recibió 27.819 IU/week contra 25.906 IU/week en el grupo bajo.
•    Por los días 90 y 180 el grupo alto de sEpoR requirió una dosis perceptiblemente mayor de la eritropoyetina que el grupo bajo del sEpoR (26.977 IU/week contra 20.173 IU/week, p = 0.038).

Es notable que la dosis media se levantó en ambos grupos durante el período 14 a 90 días pero por otra parte bajó otra vez durante el período de 90 a 180 días como se habría previsto en los pacientes que comienzan terapia de la eritropoyetina.

2c. La hemoglobina media fue comparada para los grupos bajos y altos del sEpoR en tres puntos del tiempo (días 0 a 14, 14 a 90 y 90 a 180).
•    La hemoglobina al principio de la diálisis (días 0-14) no era estadísticamente diferente entre los grupos del sEpoR del alto y bajo (10.5 contra el magnesio 10.3).
•    Entre el día 90 y 180 había una tendencia hacia una hemoglobina más baja en el  grupo alto 12.4 del sEpoR contra 11.9 que se acercó a la significación estadística (p = 0.054).
•    Esto sugiere que aunque ambos grupos probables tenían blancos idénticos de la hemoglobina, el  grupo alto del sEpoR pudo haber deteriorado su respuesta de la eritropoyetina incluso con una dosis perceptiblemente más alta de la eritropoyetina.

Entonces los pacientes del grupo con alta cantidad de epor circulante aunque se les pusiera mas eritropoyetina no presentaban respuesta a ella, es decir no se formaron glóbulos rojos porque la epor circulante competía con la epo del eritoblasto

2.D. La cohort (estudió un grupo determinado de una población con determinadas características) fue dividida según quintiles de la dosis acumulativa del EPO durante el período del estudio, y dentro de cada uno quintiles se examinó el nivel medio del sEpoR.  Los valores medios del sEpoR según quintiles eran:
•    1:220644 pg/ml de Quintile;
•    2:213647 pg/ml de Quintile;
•    3:181628 pg/ml de Quintile;
•    4:242661 pg/ml de Quintile;
•    5:304667 pg/ml,
•    valor de Quintile de p para la tendencia = 0.038.

 Las dosis acumulativas medias del EPO en unidades según quintile eran: 1:209,00464863 de Quintile, 2:347,01962655 de Quintile, 3:459,71963362 de Quintile, 4:622,46065334 de Quintile, 5:1,077,666625,576 de Quintile.

La mayor parte de los pacientes tenían niveles bajos del sEpoR (inferior o igual 100 pg/ml). Sin embargo, un subconjunto de pacientes mostro valores perceptiblemente elevados. El diagrama de la distribución sugerido es aproximadamente 5-6 % de sujetos con enfermedad renal de la fase final (ESRD) tenía niveles de circulación altos de EpoR (>2 estándar las desviaciones del medio.

Los sujetos fueron divididos de acuerdo a  niveles medios de sEpoR en su iniciación como pacientes  crónico de hemodiálisis. Asi fueron dividios como:
•    243761299 pg/ml en el  grupo alto (n= 36)
•    1126111 pg/ml en el grupo bajo (n= 661) (p, 0.001).
•    Los valores medianos eran 2147 pg/ml (gama inter-guartile 1400-3445) y 69 pg/ml (gama intercuartil 62.5-101), respectivamente.

La tabla  1 demuestra las características basales de los grupos  altos y bajo del sEpoR. No encontramos ninguna diferencia entre los dos grupos con respecto a edad, a la raza, al sexo, al índice de masa de cuerpo (BMI), o a la presión sanguinea. Importantemente ferritina, saturación del hierro y hemoglobina no eran diferente. Además correlaciones entre  el sEpoR basal y la ferritina, la saturación del hierro, y los niveles de la hemoglobina eran también no significativo (p.0.05).










La resistencia de la eritropoyetina ha sido asociado a osteodistrofia y a la hormona paratiroides elevada (PTH), sin embargo PTH no era  diferente entre los grupos, y la correlación con PTH en el grupo entero no era significativo (r =20.03, p = 0.33). Las biopsias del hueso no están disponible para que estos temas confirmen osteodistrofia. Hipertensión elevada levemente  como una etiología de ESRD  fue representada en Grupo bajo del sEpoR. Sin embargo, los parámetros clínicos estándar no parecieron ser asociado al nivel sEpoR.

Para determinar si el nivel sEpoR  en la iniciación de la diálisis crónica se asocian a la dosis crecientes de  eritropoyetina, nosotros comparamos la administración semanal longitudinal de la eritropoyetina en los grupo bajo y Altos del sEpoR (figura 2b).
•    La administración de la eritropoyetina se  diferenciado en el tiempo (P, 0.001),  y sobre todo l estado del sEpoR cambio en los 90  días y especialmente en los siguientes 180 días  de la iniciación de la hemodialisis (P= 0.038).
•    Examinamos después los niveles medios de hemoglobina durante el mismo plazo porque la resistencia de la eritropoyetina se ha asociado con el aumento de la administración de la eritropoyetina frente a niveles mas bajos de hemoglobin.

Por el día 180, el grupo bajo del sEpoR tenía levemente más arriba niveles de la hemoglobina a pesar de la recepción de una eritropoyetina semanal más baja dosis (figura 2c).
•    Después, en las mismas personas según niveles del sEpoR basales, examinamos el acumulativo
•    la administración de la eritropoyetina como medida de la resistencia a la eritropoyetina sugerida por los investigadores anteriores
•    La administración acumulativa de la eritropoyetina sobre los siguiente de 180 días la iniciación de la hemodialisis era 542.1026330.308 IU.

Categorizamos el total de la poblaicon en estudio en quintiles de la eritropoyetina acumulativa
la administración y dentro de cada uno quintile examinó los niveles medios basales del sEpoR (figura 2.D).
•    Los que recibieron las dosis acumulativas mas altas de  eritropoyetina durante el período del estudio tenían niveles progresivamente más altos del sEpoR basal
•    Entonces realizamos análisis de regresión logísticos para determinar independiente Variables basales  asociadas a la eritropoyetina acumulativa más alta la administración (Quintile 5).
•    Además ajustamos los  niveles altos contra bajos de sEpoR, según las características ligadas previamente a la administración de la eritropoyetina incluyendo la edad, raza, sexo, causa de falta renal de la fase final (diabetes, hipertensión, glomerulonefritis, otra), y exposiciones basales tales como acceso arteriovenoso (fístula, injerto, catéter), peso, ferritina del suero, saturación de la transferrina, y niveles de PTH 
•    El riesgo para requerir la administración más alta de la eritropoyetina de los grupos altos  contra grupos bajos del sEpoR era  más alto (O 2.8, 95 aproximadamente de tres veces 1.3-6.4).






c)    BLOQUEO DE RECEPTORES EPO A TRAVÉS DE LA SEÑALIZACIÓN DE EPO IN VITRO

Intentamos después probar la hipótesis el sEpoR de circulación puede bloquear la señalización de eritropoyetina a través del receptor de membrana de eritropoyetina . Seleccionamos la variedad de células de BaF3/EPOR las cuáles son una favorable variedad de lineas pro B de  células murina (de raton) con transferencia  estable  EPOR.

Esta variedad de células se caracteriza y responde bien a la eritropoyetina aumentando la señalización intracelular vía la cinasa de Stat-5 y de la via Janus kinase2 (Jak2) dando por resultado la proliferación de célula.

Usando las células de BaF3/EpoR establecimos un sistema in vitro que permitiera testear la   Stat-5 fosforilada en respuesta la  eritropoyetina.
•    La figura 3a es una curva dosis respuesta que demuestra que el  niveles crecientes de Stat-5 Fosforilada en respuesta a una eritropoyetina cada vez mayor.
•    La figura 3b demuestra que adición de sEpoR recombinantes bloquea  la eritropoyetina mediante la fosforilación Stat-5 en este sistema en concentraciones que se extienden a partir de 50 ng/mL a 5.000 ng/mL.
•    Cuantificación de esta inhibición se demuestra en la figura 3c como el cociente de phospho-Stat-5 del total de Stat-5.

El próximo test consistió en ver el  suero de pacientes con altos niveles de sEpoR bloqueadores de señalizadores de eritropoyetina … realmente tengo la duda… We next tested whether serum from patients with high levels of sEpoR blocks erythropoietin mediated signaling… comparada al suero de pacientes con los niveles bajos del sEpoR.  Para este análisis BaF3/EpoR fueron estimulados con la eritropoyetina de 50 mU/ml adentro la presencia y la ausencia de suero de 10% seres humanos de pacientes con niveles altos y bajos de sEpoR.

•    La figura 3d demuestra una representación de western blot de este experimento.
•    Cuantificación por densitometría (Figura 3e) demuestra (p, 0.05) una disminución significativa de Stat-5 fosforilación cuando las células de BaF3/EpoR fueron expuestas al suero de pacientes con  sEpoR altos (.4000 pg/ml) con respecto a suero de pacientes con los niveles #62.5 pg/ml del sEpoR).

Análisis de la figura3:  Caracterización funcional del sEpoR.
    3a. Western blot que demuestra  que el incremento phospho-Stat-5 en presencia del aumento mU/ml de la eritropoyetina (25 a 5000) en lysates de la célula de BaF3/EpoR.
    3b.- Western blot representativa que demuestra phospho-Stat-5 y Stat-5 totales en presencia de la eritropoyetina 5000 mU/ml y que varía concentraciones del sEpoR-Fc recombinante (50 -5000 ng/ml). Phospho-Stat-5 disminuye con el aumento de sEpoR recombinante.
    3c. Cuantificación de la inhibición del sEpoR-Fc de phospho-Stat 5 (figura 3b).
o    Cocientes del phospho/de Stat-5 total (medio 6 SD, n = 3) representado como porcentaje del control (EPO solamente). *represents p, 0.05. 3d.
o    El suero de pacientes con el alto sEpoR bloquea la fosforilación de stat-5 mediada por eritropoyetina
o    Se demuestra el cociente de phospho-Stat-5 a Stat-5 según lo medido por la densitometría.
o     Las células de BaF3/EpoR del suero fueron expuestas al vehículo (control negativo), a la eritropoyetina en 50 mU/ml (control positivo) y a la eritropoyetina más el suero 10 con el sEpoR bajo (#62.5 pg/ml) o el suero con el alto sEpoR ($4000 pg/ml) por 10 minutos.
o    Las células lysed en almacenador intermediario de RIPA y 10 ug de la proteína/carril fueron funcionados en un gel de desnaturalización 4-12.
o    Los geles fueron transferidos y borrados con anti-Stat-5 y anti-phospho-Stat 5.
    3e. Cuantificación de los western data (figura 3d).
o    Cocientes del phospho/de Stat-5 total (el medio 6 SD, n = el paciente individual 5 muestrea cada uno para el sEpoR bajo y el alto sEpoR) representados como porcentaje del control (EPO solamente).






d)    EL sEPOR ES AUMENTADO CON CITOQUINAS INFLAMATORIAS COMO  IL-6 Y TNF-A

La fuente de sEpoR EN circulación es desconocido. Existe posibilidad de que los niveles de sEpoR estén regulados  , y de que tengan función fisiológica en algunos tejidos. Algunos han observado una correlación positiva entre los niveles del sEpoR y el grado de la eritropoyesis, mientras que
otros no han observado una asociación.

Además, recientes  datos demuestran una correlación entre niveles de TNF-a, IL-6 e IL-8 elevados
y anemia en pacientes con la enfermedad de riñón crónica. Nosotros presumido que el sEpoR se puede estimular por citoquinas inflamatorias presentes en los pacientes urémicos. Para probar esta hipótesis seleccionamos las células K562 una variedad de células que expresa EpoR. Utilizamos el éster del phorbol (PMA) como control positivo ya que se ha demostrado que puede  inducir la secreción de receptores del factor de crecimiento soluble en otras variedades de células

•    Encontramos ese sEpoR en la célula supernatars fue aumentado perceptiblemente niveles basales ante la exposición a PMA, a IL-6 y a TNF-a pero no a IL-8 (figura 4a).
•    Medimos los niveles de  circulación de IL-6 en un subconjunto de pacientes con alta sEpoR y sEpoR bajo y encontrado que los niveles IL-6 estaban en promedio 2.5 veces más arriba en sujetos con  niveles altos de circulación de sEpoR que en sujetos con el sEpoR bajo nivela (figura 4b).


Análisis de la figura 4 . sEpoR es regulado por citoquinas proinflamatorias

4ª.- IL-6, TNF-a y PMA aumentan el sEpoR en el sobrenadante de las células K562. K562 fueron puestos en medios sin suero y expuestos a las 48 h, a PMA, a IL-6 y a TNF-a.  En el final de la incubación las células fueron granuladas y el supernatats se sometió  a ELISA para determinar el sEpoR. Las medidas del sEpoR fueron corregidas para la concentración de la proteína total. * representa p valor de, 0.05 cuando está comparado al grupo de control.

 4b. Los niveles medios de IL-6 en sujetos con el sEpoR bajo (n = 32) y alto (n = 32).
* representa valor de p de, 0.05 cuando está comparado al grupo bajo del sEpoR.









4.- Discusión

En este estudio demostramos que el sEpoR está presente en el suero de pacientes en la iniciación de CHD, y estos niveles más altos en el comienzo de la diálisis  están independientemente asociados  a dosis de la eritropoyetina administrada en los 6 meses de seguimiento de comienzo del tratamiento.

    También demostramos que el sEpoR es una proteína funcional e inhibe la fosforilación mediada eritropoyetina Stat-5.
    Demostramos que ese suero con altos  niveles del sEpoR disminuye la fosforilación mediada eritropoyetina Stat-5 comparada con el suero de pacientes con el sEpoR bajo, lo que sugiere que  sEpoR puede competir con la membrana EPOR de modo que inhiba la eritropoyesis estimulando la eritropoyetina.
    Sugerimos  un mecanismo para determinar niveles elevados sEpoR, demostrando que IL-6 y TNF-a puede aumentar la producción del sEpoR en el supernatant de líneas celulares que expresan EpoR endógeno.
    Importantemente, también demostramos que sujetos  con  alto sEpoR en promedio tenía más niveles superiores de circulación de IL-6 que sujetos con el sEpoR bajo.

La hipótesis sobre que el sEpoR puede modular la señalización de eritropoyetina tiene plausibilidad biológica por varias razones.
    Primero, otros investigadores han demostrado que el sEpoR puede bloquear la señalización de EpoR  in vitro
    En segundo lugar hay datos recientes para sugerir ese sEpoR puede inhibir la señalización de la eritropoyetina in vivo. EpoR soluble es expresado en el cerebro y es un down-regulated en respuesta a hipoxia crónica en un modelo murine recientemente descrito. Esta down-regulated contribuye a incrementar la  ventilación por minuto.
    La infusión del sEpoR exógeno disminuye la eritropoyetina endógena señalización y bloquea el aumento en la ventilación . También, la expresión transgénica del sEpoR puede bloquear la eritropoyetina en una rata modelo.
    Además, muchos cytokines de la superfamilia de las proteínas de  transmembrana tipo 1 (cuyo EpoR es un miembro) son sintetizado en formas solubles, y altere la unión al el receptor nativo

Dos otros grupos han divulgado niveles del sEpoR en pacientes con enfermedad de riñón crónica o en diálisis pero ellos no fueron capaces de demostrar un papel fisiológico de esta proteína. Aquí confirmamos la presencia de sEpoR gracias a la inmunoprecipitación y ELISA del suero y demuestramos que el suero enriquecido en sEpoR inhibe la eritropoyetina mediante la fosforilación Stat-5 que sugería  que sEpoR puede tener un papel fisiológico,  y que se relacionó con el grado de eritropoyesis.

Especulamos que los niveles del sEpoR se pueden modular con citoquinas presentan en el estado inflamatorio crónico presente dentro muchos pacientes de diálisis. Los datos con respecto a la regulación del sEpoR son limitados, EpoR  regulado por varios cytokines tales como TNF-a, IL-1b, e IL-6

La hipoxia y la eritropoyetina pueden también estimular la expresión de Epo, ya que  EpoR es regulado por el factor hipoxia-inducible 1. y las demostraciones recientes de los datos aumentaron la expresión primaria EpoR en  células humanas y médula endoteliales venosas de células vascular
 bajo condiciones hipóxicas y en respuesta a eritropoyetina.

•    Es desconocida si el sEpoR se produce en proporción a EpoR o si se regula independientemente. La degradación lisosomal  desempeña un papel importante en la alteración de la expresión receptores de superficie para ctoquinas.
•    Interesante, el bloqueo de la degradación lysosomal de EpoR con inhibidores calpain aumentó el sEpoR  por 2 a 5 veces,  pero aumentó EpoR de la membrana aumento solo en  1.5  veces mostrando diferencia por  la regulación de estas dos  proteínas.

Aquí proporcionamos evidencia que IL-6 y TNF-a pueden aumentar sEpoR en el supernatans de las células que expresar el receptor natural y los sujetos con el  sEpoR alto en promedio tenían más arriba los niveles de circulación de IL-6.
•    Esto sugiere un mecánico posible de acoplamiento entre la inflamación y la resistencia de la eritropoyetina.
•    Nuestros datos preliminares sugieren que nivles sEpoR elevados en la iniciación de CHD identifica a los sujetos que requieran una dosis eritropoyetina más alta durante los 6 meses de seguimiento.
•    Importantemente, los niveles del sEpoR eran correlacionado con otros parámetros considerados ligó a resistencia tal como ferritina, saturación de la eritropoyetina del hierro, y niveles de hormona paratiroides.
•    Dosis más altas de la eritropoyetina eran recibido en el contexto de alcanzar de valores más bajos de la hemoglobina comparado a ésos con niveles más bajos del sEpoR.

Es interesante decir, que las dosis semanales de la eritropoyetina se diferenciaron  lo más marcado posible entre los días 90 y 180. Esto puede ser porque el comienzo  dosis de la eritropoyetina es generalmente similar cuando los pacientes inician CHD (como lo visto en la figura 2b) dada la hemoglobina baja nivela en  iniciación de la hemodialisis y la facilidad de la administración de dosis estándar en unidades ocupadas de la diálisis. En este contexto, es posible que  la resistencia de la eritropoyetina se de con postereoridad (incluso en una forma sutil) Además, puesto que el período de glóbulos rojos es 120 los días, es probable que los efectos del sEpoR sean más prominentes en 180 días algo que en 90 días.

Hay demostración reciente de los datos que una dosis más alta de la eritropoyetina está asociada a aumentado de la mortalidad, y un subconjunto de pacientes requieren perceptiblemente más altas cantidades de eritropoyetina para sostener un nivel de hemoglobina adecuada. No está claro si esto se relaciona con la eritropoyetina en sí mismo, o si es asociado a factores de riesgo tales como inflamación crónica. Para este estudio elegimos examinar de cerca el acoplamiento entre los niveles del sEpoR y dosis subsecuentes de la eritropoyetina, por lo tanto requerimos todos los sujetos  que seguían vivos durante el período del estudio. Los estudios futuros deben ver si puede haber un acoplamiento entre los niveles del sEpoR y resultados incluyendo muerte.

En esta descripción de la inicial el nivel de sEpoR fueron identificado independientemente los que requerimientos de dosis más altas de la eritropoyetina en los 6 de seguimiento meses incluso después explicar las características  basales clínicas y medidas del laboratorio.

En estos análisis controlamos de manera rutinaria factores ligados previamente a resistencia de la eritropoyetina, incluyendo PTH, estado del hierro, y medidas de inflamación tales como ferritina. Sin embargo, no hicimos los marcadores de circulación nuevos de la medida se asociaron a la resistencia a la eritropoyetina  tal como:
•    pro-hepcidin para las cuales puede ser un marcador la inflamación que altera la disponibilidad del hierro,
•    receptor soluble de  transferrina que se ve disminuido en enfermedad crónica de riñón
•     proteína C-reactiva (CRP)  ya que pacientes con CRP elevado requiera una dosis más alta de la eritropoyetina, que pueden disminuir el clearence  de cytokines inflamatorios por ejemplo TNF-a, IL-1 e IL-6.
•    Los nivels altos de cytokines pueden tener acción sobre la eritropoyetina en las  células  precursoras de la médula. Es también posible que algunos cytokines inflamatorios pueden regular la producción ellos mismos o que regulen que sEpoR se pueda asociar a un factor común.
•    Nuestros datos in vitro sugieren que IL-6 y TNF-a puede estimular directamente la producción del sEpoR. En trabajos futuros es razonable medir la pro-hepcidin, Receptor soluble de transferrina, CRP, IL-6 y TNF-a para ver si ninguno de estos factores se asocian a los niveles del sEpoR.

Estudiamos sujetos representantes de la diálisis de los E.E.U.U.  Sin embargo, la dosificación de la eritropoyetina varía perceptiblemente cerca el país con la mayoría estudia demostrar las dosis más altas en Estados unidos. Una revisión reciente de la eritropoyetina que dosifica patrones en 12 los países demostraron esa dosis semanal media de la eritropoyetina entre los pacientes de diálisis estables crónicos en los E.E.U.U. eran los más altos en 17.360 IU por la semana comparada con un punto bajo de 5.297 por semana en Japón.

En esta mayor dosis de la eritropoyetina del estudio fue asociada a mayor concentración media de la hemoglobina. Nuestros resultados necesitarían ser validado en otras poblaciones pacientes, incluyendo europeo y Grupos asiáticos para determinar generalización. Nuestros datos pueden tener importancia particular a los temas del cáncer como varias variedades de células del tumor
se han demostrado al sEpoR secreto [26] y en quién dosis más altas de la eritropoyetina se han asociado a la mortalidad

Los datos presentaron demostrar el sEpoR creciente en respuesta a IL 6 y TNF-a son preliminares. El trabajo futuro incluye un análisis completo de el sEpoR en respuesta a éstos y el otro potencial inflamatorio cytokines. Las preguntas que se contestarán incluyen:
•    cuál está el efecto del EpoR de membrana? 
•    cuanto es el tiempo para el sEpoR se libere?
•    es sEpoR regulado a nivel de traduccion y trancripcion?
•    ¿o nivel poste-transcriptivo?

 Importantemente, también no sabemos si el sEpoR se puede también implicar en la patogénesis  de la enfermedad crónica anemica, a la cual es también probablemente secundario inflamación crónica

En resumen, nuestros resultados sugieren que el sEpoR pueda desempeñar un papel adentro la respuesta de los pacientes de diálisis a la eritropoyetina exógena y el sEpoR se puede producir en respuesta a cytokines inflamatorios.
A una mejor comprensión de la regulación del sEpoR y de su asociación con otros factores sabidos para contribuir a la resistencia de la eritropoyetina podrían llevarse a una dosificación más estratégica y más eficaz de la eritropoyetina. Si el sEpoR se puede demostrar en otros estudios para inhibir eficacia de la eritropoyetina en los pacientes de diálisis entonces terapéuticos las estrategias dirigidas disminuyendo el sEpoR pueden ser útiles
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